국내 연구팀이 새로운 세포사멸 프로그램(네크롭토시스^*)의  한계점을 극복하여, 암세포의 항암제 반응성을 극대화함으로써 안전하고 효과적인 항암치료의 새로운 지평을 열었다.

    

해결의 열쇠는 네크롭토시스를 조절하는 핵심 단백질(RIP3^**)에 있었다. 그동안 RIP3는 고체형태의 암에서 현저히 감소되어 새로운 암세포 사멸 전략으로 활용하는 데에 한계가 있었다.

연구팀은 암세포에 탈메틸화제^*를 투여하는 새로운 방식을 도입하여 암 발생으로 감소된 RIP3를 복구하는데 성공하였다. 

   

동물실험을 통해, 고체 형태의 암에 탈메틸화제를 투여하여 RIP3 발현을 증가시킨 뒤 항암제를 투입한 결과 항암제만 투여한 그룹에 비해 쥐의 종양이 현저하게 줄어드는 것을 확인하였다. 

아울러 유방암 환자의 조직을 검사한 결과 RIP3의 발현이 정상조직에 비해 현저히 저하되어 있는 것을 발견했다. 그리고 상대적으로 RIP3의 발현이 높은 환자의 생존율이 높다는 것을 확인함으로써, 동 성과가 유방암 등 인체의 암세포에 적용되어 항암치료의 새로운 전략이 될 수 있는 가능성을 보았다. 

이번 연구는 아주대 김유선 교수(교신저자)와 구기방 박사과정(제 1저자)이 미래창조과학부와 한국연구재단이 추진하는 기초연구사업(선도연구센터 및 중견연구자지원)의 지원으로 수행되었고, 네이처 자매지인 셀 리서치(Cell Research) 5월 8일자 온라인판에 게재되었고, 국내·외에 관련 특허^*를 출원하였다.

    

    

* 해외특허명 : RIP3 발현촉진제를 유효성분으로 포함하는 항암보조용 조성물. RIP3 발현을 촉진하여 항암제 감수성을 증진시키는 항암 보조제 스크리닝 방법 및 항암제 감수성 모니터링 방법 (PCT/KR2014/011376)

    

김유선 교수는 “이번 연구는 단백질을 통해 암세포 자살을 유도하는 새로운 사멸 프로그램의 실현 가능성을 한 단계 앞당긴 뜻 깊은 성과”로, “RIP3의 조절을 통해 암세포의 항암제 반응성을 높이고 새로운 암세포사멸 프로그램을 기반으로 하는 효율적 암 치료제 개발에 큰 기여를 할 것으로 기대된다”고 밝혔다.

아울러, 이번 성과는 정부의 ‘제2기 암정복 10개년 계획(‘06~’15)‘에서 밝혔던 세계적 수준의 진단·치료 기술개발에 따른 주요 성과로, 암 치료를 위한 기술개발과 상용화에 더욱 탄력이 붙을 것으로 기대된다.

   

암세포의 대표적 특징 중 하나인 아폽토시스(apoptosis)에 대한 저항성은 암세포가 항암제에 저항할 수 있게 함으로써, 암세포 사멸 전략의 한계점을 가져왔다. 최근 제시된 새로운 세포사멸 프로그램인 네크롭토시스(necroptosis)가 암세포사멸을 극복할 수 있는 가능성이 있을 것으로 기대를 모았으나, 네크롭토시스의 핵심조절인자로 알려진 RIP3 가 대부분의 고형암에서 발현되지 않아 새로운 암세포 사멸프로그램으로 활용하는 데에는 한계가 있는 것으로 생각되었다.  

   

연구진은 탈메틸화제를 이용하여 대부분의 고형암에서 발현이 억제된 RIP3를 복구시킬 수 있다는 것을 보고하였으며, DNA 메틸전달효소1(DNMT1)이 RIP3의 발현 억제에 중요한 역할을 한다는 사실을 규명하였다[그림1]. 또한 암세포에서 RIP3의 발현을 유도하였을 경우, 암세포 사멸이 현저하게 증가됨을 확인하였다. 이때 발생하는 세포사멸은 기존의 네크롭토시스 신호전달 경로를 경유함을 규명함으로써, 네크롭토시스의 핵심조절인자인 RIP3의 발현이 새로운 암세포 사멸 전략 및 타겟이 될 수 있음을 확인할 수 있었다[그림2]. 

   

더욱이 유방암 환자의 조직을 분석한 결과 암조직에서 RIP3 의 발현이 정상조직에 비해 현저히 저하되어 있으며 RIP3 의 발현이 높은 환자의 생존율이 높은 것을 확인할 수 있었다[그림3]. 이러한 결과는 마우스에 종양을 유도한 다음 탈메틸화제를 투여한 후 항암제를 주사한 그룹에서 종양의 크기가 항암제만 단독으로 투여한 그룹에 비해 현저히 줄어들어 있음을 확인하여 RIP3 매개의 암세포사멸 전략이 새로운 항암 치료전략이 될 수 있는 가능성을 제시하고 있다[그림4]. 

   

본 연구는 암에서 RIP3 단백질이 후성유전학적으로 발현이 억제되어 네크롭토시스에 의한 암세포사멸에 대한 저항성을 보임을 밝혔으며, RIP3 단백질의 발현조절을 통해 암세포의 항암제 반응성이 증가된다는 사실을 통해 새로운 암세포 사멸 전략을 제시하였다.

   

네크롭토시스 조절을 통한 암세포사멸은 새롭게 부각되고 있는 패러다임으로 아직 밝혀진 부분이 거의 없는 새로운 분야이다. 본 연구진은 암에서 네크롭토시스를 통한 세포사멸의 핵심적인 분자 기전을 규명함으로써 해당 연구 분야에서 선도적인 역할을 할 수 있을 것으로 기대된다. 

   

특이적인 신호전달기전을 조절할 수 있는 약물을 통한 맞춤형 치료제 개발의 필요성이 증대되고 있는 시점에, 본 연구를 통해 네크롭토시스에 대한 항암제 반응과 역할을 규명함으로써 암에서 선택적 치료가 가능한 항암제 개발에 기초자료로 활용할 수 있다. 더 나아가 암 환자에서 네크롭토시스 관련 유전자 혹은 단백질 발현 상황에 맞는 개인 맞춤형 치료 의학을 적용하여 항암제에 대한 부작용 감소, 치료 효율 증대, 치료비 감소 등의 파급 효과를 가질 것으로 기대된다.

  

또한 암화 과정에서 발현이 억제되는 네크롭토시스 관련 인자의 바이오마커를 활용한 진단 키트를 개발함으로써 암화 과정을 막고 조기 진단의 방법으로 응용하여 암환자 생존율을 향상시킴으로써 국민보건 및 삶의 질 향상에 기여할 수 있다.

1. 새로운 암세포 사멸 프로그램인 Necroptosis를 활성화시킬 수 있는 조절 단백질을 발굴

2.  발굴된 단백질인 RIP3 가 암세포에서 어떤 기전을 통해 암세포를 새로운 사멸 프로그램인 Necroptosis를 유도시키는지를 규명

신규 항암제 개발 및 조기진단 바이오 마커로 활용가능

본 연구결과는 암치료의 새로운 개념과 검증된 치료표적을 제시하는 기초연구로서, 치료제 후보물질 발굴 및 임상 단계의 시도와 속도에 따라 실용화 소요시간이 결정될 것

Necroptosis의 분자적 기전을 규명하고, 약물 스크리닝을 통해서 RIP3의 발현을 유도하거나, 활성화시키는 약물 개발이 필요함. 또한 바이오 마커로 활용하기 위한 validation이 요구됨.

새롭게 떠오른 세포사멸 프로그램인 Necroptosis를 암세포사멸의 한계를 극복할 수 있는 기전이라 믿고, 암세포에서 Necroptosis 의 핵심조절인자인 RIP3 가 현저히 감소 또는 억제되어 있다는 사실에 주목하여 연구를 시작함.

우리가 논문에서 보여준 암세포의 RIP3 발현을 분석한 데이터는 60개가 조금 넘는 암세포주를 보여주고 있지만 실제로는 같은 세포도 실험실마다 성질이 다르다는 점을 감안해 100개 이상의 세포주를 반복 확인하고 도표화 하는 작업을 할 정도로 많은 시간을 투자하여 Figure 하나를 완성할 수 있었음.

RIP3를 타겟으로 하는 신규 항암제 개발 및 바이오 진단 시스템의 임상적 활용 .

실험실에서 세포수준에서 확인한 결과를 마우스 모델에 적용하고 분석하고, 그리고 환자샘풀을 얻어 직접분석하고 최종적으로 기존의 발표된 데이터베이스를 통한 검증으로 연구한 내용이 실제 암환자의 치료에 도움이 될 수 있다고 믿기에 힘들지만 아무나 할 수 없는 선택된 연구자라 생각하고 늘 용기와 격려를 스스로에게 주길 바람. 

 1. 네크롭토시스 (Programmed necrosis, Necroptosis)

괴사(Necrosis)는 조절되지 않는 수동적 세포사멸 과정으로 인식되었으나, 최근 관련 연구가 진행되어 조절인자들이 밝혀짐으로써 "Programmed necrosis=Necroptosis"라는 표현을 사용함. 대표적 조절인자는 RIP1, RIP3, MLKL이다. 

 

계획된 세포죽음으로 세포가 스스로 자살해 사멸하는 것을 말함. 세포(細胞)가 유전자에 의해 제어되어 죽는 방식의 한 형태로 세포의 괴사나 병적인 죽음인 네크로시스와는 구별된다. 아포토시스는 발생 과정에서 몸의 형태 만들기를 담당하고, 성체에서는 정상적인 세포를 갱신하거나 이상이 생긴 세포를 제거하는 일을 담당하고 있다

 

새로운 세포사멸 모드인 necroptosis 조절의 핵심 단백질로 serine threonine kinase (세린 트레오닌 인산화 효소)

DNA의 메틸화, 히스톤 메틸화/아세틸화 등이 크로마틴 구조 변화와 더불어 이들의 분자구조 및 구조 변환을 통해 유전자의 발현을 조절하는 학문

 

유전자(DNA)의 메틸기(메테인에서 수소 원자 하나를 제거한 원자단)를 제거 또는 감소시키는 약물

특징 유전자의 CpG site를 메틸화 시킴으로써 유전자의 발현을 조절하는 효소

- 다양한 암세포주에서 RIP3의 발현이 억제되어 있음을 western blot이라는 생화학적 기법을 이용하여 확인하였다(A). 각각의 세포로부터 단백질을 분리하여 전기영동한 다음 RIP3 항체와 반응시켜 RIP3 발현을 확인함. RIP3의 발현은 탈메틸화제(Hypomethylting agent:5AD)의 처리전에 관찰되지 않았으나 탈메틸화제의 처리 후 RIP3 밴드가 확인되었다(B). 

- 암세포에서 RIP3의 역할을 규명하기 위해서, Lenti-virus 시스템을 이용하여 RIP3가 발현하지 않는 암세포주에 RIP3를 발현시켰다. 그리고 다양한 항암제를 처리함으로써, 암세포 사멸에서 RIP3의 역할을 규명하고자 하였다. RIP3가 발현하는 암세포주(그래프의 검은색 바)는 그렇지 않은 암세포주(그레프의 회색바)에 반하여 세포사멸이 현저히 증가되어 있음을 확인(그래프의 수치가 클수록 많이 살았음을 의미)할 수 있다(A). RIP3가 발현하는 암세포주가 항암제에 의한 세포사멸이 증진되어 있는 것은 RIP3의 하위 신호 전달 매개자인 MLKL을 통해서 Necroptosis가 발생하기 때문이라는 사실을 증명하였다(B: RIP3 단백질이 MLKL 이라는 단백질과 복합체를 이루어 암세포사멸을 유도시켜 MLKL 유전자의 발현을 억제한 #1, #2, #3의 암세포는 사멸이 현저히 줄어들었음. 그리고 이 두 단백질이 항암제 처리시에 복합체를 이룬다는 것-노란색으로 보이는 부분-을 공촛점 현미경을 통해 분석 함). 

- 실제 유방암 환자에서 RIP3의 발현 패턴 및 생존율을 분석하였다. 동일 환자의 정상(normal:N)과 암(tumor:T) 조직을 분석하였을 때 암조직에서 RIP3의 발현이 현저하게 감소되어 있음을 분자생물학적 기법을 이용하여 증명하였다(A). 또한 암환자의 정상부위와 암조직을 RIP3 항체를 이용해 염색한 결과 정상조암조직에서는 RIP3 의 발현이 현저히 감소 (발현하는 경우 붉은색으로 염색됨) 되어 있고 암조직내 정상세포는 RIP3가 발현되는 것이 화살표로 표시되어 있음, 또한 RIP3 발현에 따른 암환자의 생존율을 분석하였을 때, RIP3의 발현이 높은 암환자 (초록색 선)의 경우 생존율이 더욱 증가되어 있음을 알 수 있다(B). 

- 암세포 사멸에서 RIP3의 역할을 In vivo 시스템을 통하여 규명하기 위해서 마우스 모델에 RIP3가 발현하지 않는 유방암 세포주를 주입하여 Xenograft 모델을 만들었다. Tumor가 형성된 이후 Hypomethylating agent(5AD)와 Doxorubicin을 단독 또는 병합 처리하였다. 이전의 결과와 마찬가지로 5-AD를 처리한 그룹에서는 RIP3의 발현을 유도할 수 있었으며, 5-AD와 Doxorubicin을 병합 처리하였을 경우 단독에 비하여 현저히 증가된 암세포 사멸 효과를 확인할 수 있었다(A,B). 5-AD에 의한 RIP3의 발현 유도는 암세포의 항암제에 대한 감수성을 급격히 증가시킴을 다양한 면역 화학적 그리고 분자생물학적 접근법을 통해서 증명하였다(C-F). 이러한 결과는 In vitro에서의 RIP3의 항암제 감수성에 대한 결과를 뒷받침해주는 결과로써, RIP3가 새로운 암세포 사멸 전략의 타겟이 될 수 있다는 가능성을 제시한다. 

암의 발생과정에서 RIP3 단백질의 발현이 억제되어 있는데, 이로 인해 새로운 암세포 사멸모드인 네크롭토시스가 유도될 수 없음.  암화 과정에서 RIP3 의 발현이 후성 유전학적 조절 기전인 메틸레이션에 의함을 확인하고 탈메틸화제 (5-AD)를 처리하여 RIP3 의 발현을 복구한 결과 암세포에서 항암제에 의한 네크롭토시스가 유도되어 잘 죽게 됨.