항암제와 신경퇴행성 질환 치료제 개발에 필요한 전이효소^*의 구조와 퀴놀린산 처리의 작용 메커니즘이 밝혀졌다. 

한국연구재단(이사장 정민근)은 미래창조과학부(중견연구자지원·방사선기술개발사업)의 지원을 받은 엄수현 교수 연구팀(광주과학기술원)이 에너지 생산 효율을 극대화하는 체내 조효소인 NAD^**를 합성하는 퀴놀린산 포스포리보스 전이효소(QPRT)^***의 고해상도 3차원 구조와 기능을 처음으로 규명했다고 밝혔다.  

        

퀴놀린산은 신경 독소로 작용하며, 신경계에 과다하게 축적되면 다양한 신경퇴행성 질환과 신경교종^****을 유발한다. 때문에 전이 반응을 통해 신경계 내 퀴놀린산을 다른 물질로 바꾸는 QPRT의 기능을 연구하여 퀴놀린산의 신경계 내 축적을 방지하는 원리를 밝히고, 이를 이용해 신약을 개발하는 연구가 진행되고 있다. 하지만 아직 QPRT의 효소반응 각 단계별 3차원 구조가 밝혀지지 않아 QPRT의 작용 원리를 파악하지 못하고 있다. 

       

엄수현 교수 연구팀은 X-선 결정학 기법^*****을 이용해 인간 QPRT의 효소반응 단계별 고해상도 3차원 구조를 규명하고, QPRT가 6량체^******로 존재함으로써 효소의 반응이 진행되는 동안 활성부위가 열린 형태로부터 닫힌 형태로 광범위한 구조적 변화가 일어남을 확인했다. 

       

****** 6량체 : 분자 여섯 개가 모여 활성을 나타내는 형태. QPRT는 두 개의 분자(2량체)가 기본 단위이지만 2량체 세 개가 모여 6량체를 형성하여 활성을 최적화함.  

현재까지는 모든 종의 QPRT에서 닫힌 구조만이 보고 되었으나, 연구팀은 인간 QPRT의 열린 구조를 최초로 규명하였다. 또한 효소반응 단계별 구조를 규명함으로써 QPRT의 효소 작용 원리를 규명할 수 있었다. 이는 열린 구조를 대상으로 하는 구조기반 신약개발에 핵심적인 구조정보를 제공하여 신경교종 저해제 개발에 기여할 것이다. 

또한 원핵생물^*******의 QPRT는 2량체로 활성을 가지는 반면, 인간을 포함한 진핵생물^********의 QPRT는 6량체로 존재하는데, 그 이유가 알려지지 않았다. 연구팀은 생화학/생물리화학 연구를 통해 2량체보다 6량체를 형성함으로써 안정성, 효소활성 등이 비약적으로 향상되는 방향으로 진화되었다는 사실을 밝혀냈다. 

       

엄수현 교수는 “이번 연구 성과는 QPRT에 의해 신경독소 퀴놀린산^*********이 뇌 안에서 일정 양을 유지하는 원리를 처음으로 밝힌 것으로 알츠하이머병, 간질 등 다양한 신경퇴행성 질환, 뇌종양 치료제 개발에 기여할 것으로 기대돼 학계의 관심이 모아지고 있다”고 연구의 의의를 설명했다. 

   

********* 신경독소 퀴놀린산 : 중추신경계에 존재하는 신경전달물질의 일종으로 신경퇴행성 질환과 밀접히 연관되며, 최근 자살 충동이 강한 사람에서 다량 존재한다는 연구 결과가 보고되었음. 

이 연구성과는 세계적 학술지 네이처(Nature) 자매지인 사이언티픽 리포트(Scientific Reports)에 1월 25일 게재되었다. 

  - 논문명 : Structural Insights into the Quaternary Catalytic Mechanism of Hexameric Human Quinolinate Phosphoribosyltransferase, a Key Enzyme in de novo NAD Biosynthesis

  - 저자 정보 : 엄수현 교수(교신저자, 광주과학기술원), 윤형섭 박사과정, 김태균 박사(공동 제1저자, 광주과학기술원)  

  

QPRT는 세포 생존에 필수적인 조효소 NAD 생합성 경로의 핵심 효소로, 원핵생물과 달리 인간을 포함한 진핵생물에서는 기본 단위인 2량체 3개가 모여 6량체로 작용함이 알려져 있다. 

       

* 진핵생물 : 핵막으로 둘러싸인 핵을 가진 세포로 형성된 생물로, 대부분의 동식물과 진핵균류를 포함. 

퀴놀린산은 NAD의 생합성 재료임과 동시에 신경 독소로 작용한다. 퀴놀린산이 신경계에서 비정상적으로 축적되면 다양한 신경퇴행성 질환을 유발한다. 최근 신경교종의 생존 및 침윤에 있어 QPRT가 필수적임이 보고되어, 이를 이용한 뇌종양 치료제 개발 표적 단백질로 크게 주목받고 있다. 그러나 QPRT의 6량체 작용 기전은 3차원 구조의 부재로 말미암아 현재까지 알려진 바가 거의 없었다. 

 

인간 QPRT 6량체 결정의 X-선 회절을 이용, 효소의 반응 단계별 고해상도 3차원 구조를 규명하였으며, 효소의 반응이 진행되는 동안 두 2량체 사이에 존재하는 활성부위에서 광범위한 구조적 변화가 일어남을 확인하였다.

     

이러한 구조적 변화는 반응물인 퀴놀린산이 효소에 결합하고 포스포리보스가 전이됨에 따라 효소의 화학결합이 달라지는 것에 기인하며, 퀴놀린산 하나가 결합하면 효소 두 분자의 구조가 변화하여 또 다른 퀴놀린산의 접근을 용이하게 한다.

QPRT의 3차원 구조 분석 및 다양한 생화학 연구를 통해 효소가 6량체로 존재함으로써 반응이 두 2량체 간 상호작용을 통해 협동적으로 조절된다는 것과 이에 따른 원자 수준의 전체 반응 기전을 최초로 규명하였다. 

효소 반응 단계 별 구조적 변화를 기반으로 생성물 구조에 화학 작용기를 추가함으로써 QPRT와 강하게 결합하여 추가 반응을 저해하는 신경교종 억제제 합성 전략을 제시하였다. 

 

NAD는 세포 에너지 생성 과정 중 산화적 인산화를 매개하는 핵심 조효소임. 유전자 수리, 염색사 교정, 세포 노화 및 사멸의 조절 등 생존에 필수적인 다양한 생명 현상과 관련됨. QPRT는 필수아미노산인 트립토판으로부터 형성된 퀴놀린산에 포스포리보스를 전이시켜 NAD 합성 전구체인 니코틴산 모노뉴클레오티드를 생성하는 효소로 원핵생물과 달리 인간을 포함한 진핵생물에서는 기본 단위인 2량체 3개가 모여 6량체로 작용함이 알려져 있음. 

* 원핵생물 : 원핵이라 불리는 원시적인 핵을 가지는 생물로 바이러스, 세균, 남조류 등을 포함.

퀴놀린산은 NAD 합성에 쓰임과 동시에 신경 독소로도 작용 가능하며, 신경계에서의 과다한 축적이 헌팅턴 무도병을 야기시킬 수 있음이 1980년대에 보고된 이래, QPRT의 비정상적인 작동은 알츠하이머병, 에이즈 유도 치매 및 간질 등 다양한 신경퇴행성 질환과 밀접하게 연관되어 있음과 더불어 자살을 시도한 사람의 뇌에서 다량의 퀴놀린산이 검출된다는 사실이 밝혀짐으로써 QPRT에 의한 퀴놀린산의 신경계 내 항상성 유지의 중요성은 꾸준히 증대되어 왔음. 

     

특히 대표적 악성 뇌종양인 신경교종은 생존 및 침윤을 위해 조효소 NAD를 이용한 대량의 에너지 생산을 필요로 하는 암세포의 특징을 보임. 최근 신경교종의 에너지 생산에 필요한 NAD는 QPRT를 이용한 경로로만 합성할 수 있으나 반응물인 퀴놀린산은 만들 수 없어 정상 세포로부터 퀴놀린산을 빼앗아 이용한다는 독특한 체계가 보고되었음. 이에 따라 QPRT의 NAD 합성 체계를 이용한 신경교종 치료제 개발 표적 단백질로 크게 주목받고 있음. 그러나 QPRT의 6량체 작용 기전은 단독 및 기질 복합체의 3차원 구조의 부재로 현재까지 알려진 바가 거의 없는 실정임.  

이에 대해 엄수현 교수팀의 이번 논문에서는 반응 단계별 3차원 구조 연구를 통해 QPRT 6량체의 작용 기전을 원자 수준에서 규명하였음.

본 연구팀은 인간 QPRT 6량체를 고농도·고순도로 대량 정제하고, 반응물인 퀴놀린산 또는 생성물인 니코틴산 모노뉴클레오티드와의 복합체를 제작한 뒤, X-선 결정학 기법을 이용하여 단독 형태 및 반응물·생성물 복합체 등 세 가지의 고해상도 3차원 구조를 세계 최초로 규명하였음.

세 구조를 비교한 결과 반응이 진행됨에 따라 2량체-2량체 상호작용 부위를 형성하는 두 고리의 구조가 크게 변화함을 확인하였음. 인간 QPRT에서 이 부분은 두 2량체 간 상호작용 부위임과 동시에 활성부위이기도 하므로, 기본 단위인 2량체가 6량체를 형성함으로써 반응 효율이 증가함을 알 수 있었음. 

인간 QPRT 6량체 형성에 있어 N-말단에 존재하는 짧은 알파-나선이 핵심적임을 밝힘 (N-말단이 제거될 경우 6량체를 형성하지 못하고 2량체만을 형성). 이에 더해, 6량체는 2량체와 비교했을 때 높은 안정성과 반응물 친화도를 나타냄을 확인하였으며 등온 적정 열량 분석을 통해 세 2량체가 6량체를 형성함으로써 반응물 결합에 있어 협동적으로 상호작용함을 규명하였음. 

단독 형태와 생성물 복합체 구조를 비교하여 단독 형태의 활성부위에 추가적인 공간이 존재하는 것을 확인하였으며, 이를 토대로 생성물 구조에 기반한 신경교종 억제제 설계 전략을 제시하였음. 

  

연구팀은 정제된 인간 QPRT 6량체에 반응물 및 생성물을 첨가하여 단독 형태 및 반응물(퀴놀린산) 또는 생성물(니코틴산 모노뉴클레오티드) 복합체 결정을 획득하였음. 

X-선 결정학 기법을 이용하여 3가지 결정에 대한 고해상도 3차원 구조를 규명하였음. 

     

* X-선 결정학: 생체고분자의 3차원 구조를 규명하기 위한 생물물리학적 기법으로, 생체고분자 단결정의 X-선 회절 패턴을 분석하여 전자밀도 지도를 획득, 원자 수준의 고해상도 3차원 구조를 규명함. 

효소의 단독 형태 및 복합체 간 구조적 차이를 기반으로 인간 QPRT 6량체의 반응이 협동적으로 조절될 수 있음을 발견하였음. 

본 연구결과는 인간 QPRT 6량체의 3차원 구조, 기능 및 퀴놀린산의 체내 처리 기전을 원자 수준에서 세계 최초로 보고하는 논문임. 

QPRT가 체내에서 비정상적으로 작동하면 퀴놀린산이 과도하게 축적되어 신경독소로 작용함. 이러한 QPRT의 체내 축적은 헌팅턴 무도병, 알츠하이머병, 에이즈-유도 치매, 간질 등 다양한 신경퇴행성 질환을 야기할 수 있음이 다수의 보고를 통해 알려져 있음. 따라서, 본 연구를 통해 도출된 결과는 퀴놀린산의 중추신경계 내 축적을 억제하는 단백질·효소 기반 신경퇴행성 질환 치료제 개발에 있어 유용한 구조-기능 정보로 사용될 전망임. 

증식 및 침윤을 위해 정상 세포보다 빠른 분열 속도를 보이는 암세포의 특성 상 에너지 생산을 위해 대량의 조효소 NAD를 필요로 함. 특히 대표적 악성 뇌종양인 신경교종의 생존에 있어 QPRT와 직접적인 연관성이 보고되었음. 본 연구에서 제시한 QPRT의 생성물 기반 저해제 개발 전략은 향후 신경교종 억제제를 비롯한 항암제 개발에 있어 핵심 구조 정보로 활용 가능할 것으로 기대됨. 

본 연구실에서는 2000년대 초반부터 NAD 생합성 과정의 중요성을 인지하여 인간 NAMPT, 병원성 세균 및 돼지의 QPRT 등 NAD 생합성과 관련된 다양한 단백질들의 3차원 구조를 규명·보고한 바 있으며, 세균, 포유류에서 인간의 QPRT 작용 기전으로 연구를 확장하고자 하는 계획의 일환으로 본 연구에 착수하게 되었다.

인간 QPRT의 단독 구조는 이미 10여년 전에 본 연구실에서 규명했으나 비교할 만한 구조가 퀴놀린산 유사체와의 복합체뿐으로, 생리적 의미를 갖는 구조 비교가 이루어질 수 없는 상황이었다. 이에 반응물인 퀴놀린산 및 생성물인 니코틴산 모노뉴클레오티드와의 복합체 구조를 규명하여 전체 작용 기전을 원자 수준에서 설명하였다. 구조를 자세히 분석해 보니 말단에 아미노산 10여 개로 이루어진 짧은 알파-나선이 6량체 형성에 크게 기여하는 것을 구조 상에서 발견하였다. 또한 아미노산 서열을 분석한 결과 포유류에서만 보존된 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 알파-나선에 의한 6량체 형성이 포유류 효소의 독특한 특징이며, 제거될 시 2량체로 존재함을 규명하였다. 기본 단위인 2량체를 획득 가능했던 시점에서 6량체와 2량체에 대한 생화학적 기능 연구를 통해 6량체가 2량체보다 반응 효율 및 안정성에 있어 월등하다는 것을 추가로 확인하던 즈음, 신경교종과의 밀접한 연관성이 보고되어 구조 분석을 통해 생성물 기반 신경교종 억제제 합성 전략을 제시하였다.  

QPRT의 3차원 구조를 규명함으로써 원자 수준의 협동적 작용 기전을 제시할 수 있었으나, 기능 연구를 통해 협동성에 대한 근거를 제시할 필요가 있었다. 하지만 본 연구실에서는 효소의 기능 연구를 위한 동역학 시스템이 구축되지 않아 애를 먹던 중 기 구축되어 있던 등온 적정 열량 분석 시스템을 이용하면 동역학 실험을 하지 않고도 효소의 협동성에 관한 정보로 변환이 가능하다는 보고에 착안하여 효소 협동성의 근거를 성공적으로 획득할 수 있었다.

본 성과는 인간 QPRT의 단독 형태 및 반응물 · 생성물 복합체의 3차원 구조를 단백질 정보 은행에 처음 등재하였고, 이들 구조를 통해 두 가지 반응물을 가지고 분자 6개가 상호작용하는 복잡한 기전을 원자 수준의 고해상도로 규명한 최초의 사례이다. 인간 QPRT의 구조들을 분석하여 효소를 구성하는 약 300개의 아미노산 중 단 10여 개만으로 어떻게 안정한 6량체를 형성하며, 왜 6량체로 기능하는지에 대해 다각도의 생물물리화학적 접근을 통해 규명하였다. 또한 일반적으로 효소를 표적으로 하는 신약을 개발하기 위한 핵심 요소인 활성부위의 구조 및 기질과의 상호작용 특징을 밝힘으로써 향후 신경퇴행성 질환 및 뇌종양 치료제 개발의 토대를 마련하였다.

QPRT 반응의 중간 단계인 퀴놀린산-포스포리보실피로인산 복합체 규명을 시도할 예정이며, 신경교종 치료제 선도물질 개발 및 혈액뇌장벽 통과를 포함한 약물 전달 체계를 확립하는 데 기여하고자 한다.

논문 리뷰 과정 중 리뷰어 한 명이 효소를 이루는 2만 5천여 개 원자 중 일반적으로 용인되는 수준인 단 10여 개에 대한 구조적 오류를 꾸준히 지적했으나, 여러 구조생물학 기법을 통해 결국 해결하여 보다 완벽한 구조를 규명·발표할 수 있었다.  

  ○ 과학 분야 최상위 학술지인 Nature의 자매지 중 하나로 2011년도부터 온라인 출판되었으며, 학술지표 평가기관인 Thomson Reuters에서 발행한 2014년 논문 인용 색인 기준 전 세계 복합과학 분야 (Multidisciplinary Sciences) 학술지 중 5위에 해당하는 영향지수 (5.578)를 가지고 있다.

  ○ 효소 반응의 보조 인자인 조효소 중 하나로, 산화 또는 환원된 두 가지 형태로 존재하며 세포의 에너지 생산 효율을 극대화시키는 산화적 인산화 반응의 핵심 요소임과 동시에 유전자 수리, 염색사 교정, 세포 노화 및 사멸의 조절 등 생존에 필수적인 다양한 기능을 수행한다.

  ○ 필수아미노산인 트립토판으로부터 형성된 퀴놀린산에 포스포리보실피로인산으로부터 포스포리보스를 전이시켜 NAD 합성 전구체인 니코틴산 모노뉴클레오티드를 생성하는 효소이다.

  ○ 신경계의 특정 부분에서 일어나는 점진적인 신경 세포의 사멸로 인한 질병을 통칭한 개념이며, 끊임없는 진행으로 인해 현재까지 개발된 약리학적·수술적 치료 방법으로는 병세의 뚜렷한 회복이 어렵다. 

  

  ○ 신경 세포의 일종인 신경교세포가 변이되어 발생하며 중추신경계 종양의 30%, 뇌종양의 80%를 차지하는 대표적 악성 뇌종양이다. 

  ○ 생체고분자의 3차원 구조를 규명하기 위한 생물물리학적 기법으로, 생체고분자 단결정의 X-선 회절 패턴을 분석하여 전자밀도 지도를 획득, 원자 수준의 고해상도 3차원 구조를 규명한다.   

 QPRT는 필수아미노산인 트립토판으로부터 형성된 퀴놀린산에 포스포리보스를 결합해 NAD의 생합성 전구체인 니코틴산 모노뉴클레오티드를 생성하는 반응을 매개한다. 

QPRT는 두 분자 사이에 활성부위를 갖는 2량체가 기본 단위이며 하나의 알파-나선과 두 고리에 의해 6량체를 형성한다.

QPRT의 반응이 진행됨에 따라 활성부위와 2량체 간 결합부위를 형성하는 두 고리에서 일어나는 광범위한 구조 변화에 의해 2량체 간 상호작용이 협동적으로 조절되어 반응 효율이 증가한다. 

생성물 복합체 구조(위)에서 양전하를 띠는 아미노산 잔기에 의해 반응물 결합부위가 닫혀 있는 반면, 단독 형태(아래)에서는 구조적 변화로 인해 열린 공간이 형성된다.