국내 연구진이 뼈의 형성을 증진시키는 새로운 골다공증 치료제를 개발 하였다. 

한국연구재단(이사장 정민근)은 미래창조과학부 선도연구센터(ERC) 사업의 지원을 받은 연세대학교 생명공학과 최강열 교수팀이 신호 전달체계(윈트신호전달체계^*)의 흐름을 막는 단백질(CXXC5^**)의 작용을 차단함으로써 뼈의 형성을 증진시키는 새로운 골다공증 치료제를 개발했다고 밝혔다

     

이번 연구는 약학 분야의 국제 저명 학술지인 엠보 몰레쿨러 메디신 (EMBO Molecular Medicine)에 3월 3일자에 게재되었다. 

      

(논문명 : Small molecule inhibitors of the Dishevelled-CXXC5 interaction are new drug candidates for bone anabolic osteoporosis therapy) 

   

o 주요 저자 정보 :  최강열 교수(교신저자, 연세대), 김현이 박사 (제1저자, 연세대) 이원태 교수 (공동연구자, 연세대) 허정녕 박사(공동연구자, 한국화학연구원), 노경태 (공동연구자, 분자설계연구소) 

기존의 치료제들은 뼈가 분해되어 없어지는 것을 막아 골밀도를 유지시키고 있으나 이 경우 새로운 골 형성이 억제되고 뼈의 질이 나빠는 등 그 한계가 분명한 상황이다. 

또한 유일한 뼈 재생성 골다공증 치료제인 재조합 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone)은 생산비용이 높고 구강 복용이 불가능하여 부작용이 발생될 가능성이 있어 대체제가 절실한 실정이다. 

최강열 교수팀은 윈트신호전달계를 저해하는 CXXC5가 그 작용점인 Dishevelled^*에 결합하는 것을 막아 뼈의 재생을 촉진하는 저분자 화합물을 발굴하였다. 또한 이 화합물을 개량하여 새로운 뼈 재생 골다공증 치료제로의 개발이 가능함을 보였다. 

     

이전 연구를 바탕으로 새로운 화합물 검색기법을 개발 하였으며, 이를 통해 조골모세포의 분화와 새로운 뼈 형성을 촉진하는 효과를 가진 저분자 화합물을 발굴하였다.

한편 난소 절제 쥐에 구강으로 투여하는 실험을 한국화학연구원 등과의 공동연구를 통해 수행하여 동 화합물을 구강으로 복용 시 골다공증을 치료하는 효과를 나타냄을 확인하였다. 

최 교수는 “골다공증 치료제 개발에 있어 Dishevelled-CXXC5 결합의 유효성을 다시 한 번 검증하고 구강 복용 가능한 뼈 재생성 골다공증 치료물질을 발굴․개발함으로써 보다 안정적이고 부작용이 적은 혁신형 골다공증 치료제(퍼스트 인 클래스 약물^*)의 개발 가능성을 보여주었다”고 밝혔다. 

뼈는 몸에 형태를 부여하고 지지해주는 조직으로써 개체의 평생에 걸쳐 가해지는 다양한 물리적인 자극을 견디어 내야 한다. 따라서 뼈 조직 내에서는 낡은 뼈를 제거하고 새로운 뼈를 만들어내는 과정이 끊임없이 반복되는데 이를 뼈의 재형성 과정(bone remodeling)이라 부른다. 뼈의 재형성 과정은 조골세포와 파골세포라는 두 세포의 상호작용에 의해 일어난다. 파골세포가 낡은 뼈를 흡수(bone absorption)하고 나면 조골세포가 새로운 뼈를 만들어 (bone formation) 그 빈자를 채운다. 두 세포는 다양한 세포외 인자들과 세포 내 신호전달계가 관여하는 복잡한 상호작용을 통해 정교하게 서로를 제어하며 이를 통해 뼈 조직의 항성성이 유지된다. 두 세포 간의 상호균형이 깨지게 되면 뼈의 밀도 이상으로 인한 질병이 발생하게 되는데, 그 대표적인 질환이 골다공증이다. 

골밀도는 사춘기를 지나 30대 초까지 이후부터 점차 감소하기 시작한다. 여성의 경우는 50세 전후 폐경이 되면서 매우 빠른 속도로 골밀도가 감소하며 남성의 경우도 65세 전후로 골밀도의 급격한 감소가 나타난다. 65세 이상 여성의 경우 2명 또는 3명 중 1명이, 남성의 경우는 5명 중 1명이 골다공증에 의한 골절을 경험하는 것으로 알려져 있다. 최근 우리나라의 평균 수명이 연장되고 노인 인구가 크게 증가함에 따라 골다공증의 치료와 예방에 관심이 증가하고 있다.

현재 흔히 쓰이고 있는 골다공증 치료법은 파골세포를 억제하여 뼈의 흡수를 막음으로써 골밀도를 유지시키는 방법이다. 비스포스포네이트(bisphosphonate) 계열의 저분자 화합물들은 파골세포의 분화를 효과적으로 억제함은 물론 인체 내 독성이 거의 없고 구강 복용이 가능한 저분자 화합물로 골다공증을 포함하여 골밀도의 저해가 나타나는 질병들에 광범위하게 쓰이고 있다. 하지만 파골세포가 억제되는 골밀도의 저해를 막는 것과 동시에 낡은 뼈의 제거 또한 저해하며, 이와 맞물려 돌아가는 새로운 뼈의 형성 또한 억제된다. 따라서 비스포스포네이트 계열의 약물을 장기간 복용 시 드물지만 매우 심각한 부작용인 악골괴사(Osteonecrosis of the Jaw)와 비전형적 대퇴골 골절(atypical femoral fracture)을 발생시킬 수 있음이 밝혀짐에 따라 새로운 골다공증 치료법에 대한 요구가 늘어나고 있다.

조골세포를 활성화시키는 재생성 골다공증 치료제는 뼈 재형성 과정 자체를 빠르게 돌림으로써 골밀도를 증진시키는 동시에 뼈의 미세구조까지 회복시키는 새로운 개념의 약물이다. 현재 임상에서 쓰이고 있는 골다공증 치료제는 재조합 부갑성선 호르몬제와 그 유사체가 유일하다. 하지만 재조합 단백질, 혹은 합성 펩타이드 형태의 이들 치료제는 구강으로의 복용이 불가능하여 항상 주사로 투약해야하는 번거로움이 있는데다 저분자 화합물 치료제들에 비해 그 생산 단가가 비싼 단점이 있다. 더구나 부갑상선 호르몬은 체내 칼슘의 대사에 큰 영향을 미치는 만큼 고칼슘혈증 발생의 위험을 높이는 한편 골육종의 발생을 일으킬 수 있음이 알려져 그 사용에 여러 제한이 따른다. 따라서 부갑상선 호르몬과는 다른 작용기작을 가지며 구강으로의 복용이 가능한 뼈 재생성 저분자 물질의 발굴이 시급한 실정이다.

   

본 연구에서는 윈트 신호전달계의 음성되먹임 저해 기작인 Dishevelled-CXXC5 결합을 저해할 수 있는 저분자 화합물들을 검색, 발굴하고 이들이 조골모세포의 분화 및 뼈의 새로운 형성을 촉진함을 밝혔다. 또한 화합물-단백질의 결합 구조를 분석하고 이러한 정보를 바탕으로 화합물을 최적화하여 그 약리학적 특성을 개선하였다. 이렇게 얻어진 화합물을 폐경 후 골다공증에 대한 동물모델로 잘 알려진 난소 절제 쥐에 구강으로 투여하여 골다공증 개선효과를 보임을 확인하였다.

1) Dishevlled (Dvl)와 CXXC5 간의 결합을 저해하는 화합물을 검출할 수 있는 시스템을 개발하고 이를 이용하여 한국화학연구원으로부터 제공받은 화합물 라이브러리로부터 Dvl-CXXC5 결합저해제를 발굴하였다 (그림 1, A-B). 발굴된 결합저해제들은 윈트 신호전달계를 활성화(그림 1, C)하는 한편 생체 외 배양된 쥐 뼈 조직의 두께성장을 촉진하는 효과를 보였다(그림 1, D). 이 중 KY-02061이라 명명된 화합물의 경우 가장 좋은 효과를 보였으며 조골모세포 및 생체 외 배양된 뼈 조직에 대해 독성을 나타내지 않았다.

2) KY-02061(그림2, A)는 Dvl-CXXC5 결합을 농도 의존적으로 저해하는 효과를 보였으며(그림2, B), 이원태 교수와 공동연구를 통한 NMR을 이용한 단백질 구조 분석 결과 Dvl 단백질의 PDZ domain에 잘 결합하는 것을 확인할 수 있었다(그림 2, A-F). 또한 KY-02061은 윈트 신호전달계를 농도 의존적으로 활성화시켰으며(그림 3, A), 조골모세포의 분화 역시 농도 의존적으로 촉진시켰다(그림 3, B). KY-02061의 처리는 조골모세포 내 뼈 분화 표지인자(Runx2)의 양을 증가시켰으며 (그림 3, C) 생체 외 배양된 쥐 뼈 조직의 두께성장을 농도 의존적으로 촉진하였다(그림 3, D-E).

3) KY-02061의 경우 생체 내에서 매우 빠른 속도로 분해되는 것으로 나타나 약으로의 유용성이 낮은 것으로 밝혀졌다. 한국화학연구원 및 (사)분자설계연구소와의 공동연구를 통해 KY-02061의 유도체들을 합성하였으며 이 중 생체 내 안정성과 Dvl-CXXC5 결합저해능이 개선된 화합물을 찾아내었다(KY-02327; 그림 4, A). KY-02327은 Dvl-CXXC5 결합을 농도 의존적으로 저해하였으며 (그림 4, B), 이 유도체가 KY-02061과 유사한 방식으로, 그러나 더 강하게 Dvl PDZ domain 결합함을 확인할 수 있었다(그림 4, C-G). KY-02327은 조골모세포에 처리 시 윈트 신호전달계를 농도 의존적으로 활성화하였으며 (그림 5, A-C) 뼈 분화 표지인자의 발현 역시 농도 의존적으로 증가하였다(그림 5, D-E).

4) 암컷 쥐의 난소를 절제한 후 4주가 지나면 골밀도가 크게 감소하며, 이는 폐경 후 나타나는 골다공증 질환의 대표적인 동물모델로 이용된다. 이 모델에 KY-02327은 경구로, 부갑상선 호르몬 유사체는 경피주사로 투여하였다. 4주 간 투여하였을 때, KY-02327과 부갑상선 호르몬 유사체가 새로운 뼈의 형성을 촉진시키며 (그림 6, A-C) 난소 절제로 인해 감소한 골량 및 골밀도를 회복시킴을 확인할 수 있었다(그림 6, D-H). 

결론적으로 본 연구를 통해 Dvl-CXXC5의 결합을 저해하는 저분자 물질이 뼈의 형성을 촉진시킬 수 있음을 발견하였으며, 이를 이용하여 경구 투여가 가능한 새로운 재생성 골다공증 치료제를 개발할 수 있음을 보여주었다. 금번 연구에서 개발한 화합물은 경구 투여가 가능한 뼈 형성 촉진 물질로써 새로운 타겟에 작용하는 신개념 저분자화합물 골다공증치료 후보물질이다.  

   

골다공증 치료제 분야의 세계시장은 작년 83억6000만 달러 규모를 형성한데 이어 향후 10년 동안 탄탄한 성장을 지속할 것으로 전망된다(‘골다공증 치료 및 예방: 2014~2024년 세계시장 전망 및 주요 관련 제약기업들의 미래 조망’, 비전게인社. 영국, 런던). 보고서는 전 세계 골다공증 환자 수가 2억 명을 상회하며, 이들 중 38%가 미국, 유럽 및 일본에 거주한다고 말한다. 또한 전 세계적인 고령화 추세에 따려 2050년이면 골다공증의 유병률은 현재의 4배 정도까지 증가할 것이라고 예측한다. 이러한 예측을 기반으로 보고서는 골다공증 치료제 시장이 2014~2024년 동안 전 세계적으로 확대를 지속할 것이라고 전망했다. 특히 일본의 경우 재생성 골다공증 치료제인 부갑성선 호르몬 제제들이 총액 대비 전체 시장의 22% 매출을 차지하고 있는데,  2021년까지 윈트 신호전달계의 음성조절자인 스클레로스틴에 대한 항체신약이 점차로 이 시장을 대체할 것으로 예측되고 있다.

본 연구를 통해 개발된 저분자 물질들은 스클레로스틴 항체들과 유사하게 음성조절자의 작용을 무력화함으로써 윈트 신호전달계를 활성화한다. 하지만 그 동안 알려지지 않은 새로운 타겟을 작용대상으로 한다는 점, 그리고 저분자 물질로써 고분자 물질인 항체신약에 비해 생산단가가 낮고 경구투여가 가능하다는 점에서 우월성을 갖는다. Dvl-CXXC5 결합을 저해하는 저분자 물질은 기존의 파골세포 억제제들의 시장을 대체함은 물론 재조합 단백질 및 펩타이드가 점유하고 있던 지금의 재생성 골다공증 치료제의 시장 역시 잠식할 수 있는 강력한 대항마가 될 것이다.

CXXC5가 결핍된 쥐의 표현형을 분석하던 중 뼈의 길이가 길고 굵어진 것을 발견하여 처음 연구를 시작하게 되었다. 이를 통해 Dvl-CXXC5 결합이 조골모세포의 분화에 중요한 역할을 함을 밝혀내었고, 이에 대한 응용을 고민하는 과정에서 본 연구를 시작하게 되었다.

이전 연구를 통해 개발한 펩타이드가 새로운 뼈 형성을 촉진한다는 것을 밝혔으나 펩타이드는 약으로 개발하기에 적당하지 않은 물질이었다. 때문에 펩타이드와 동일한 효과를 갖는 저분자 화합물을 발굴할 수 있는 시스템을 개발하였으며 이를 이용하여 한국화학연구원과 공동연구를 진행, 뼈 형성 촉진 능력을 갖는 새로운 저분자 화합물을 찾아내었다. 하지만 이 저분자 화합물은 생체 내 안정성이 떨어져 빠른 속도로 분해, 배출되어 동물실험을 하는데 부적합했다. 이에 연세대학교 생화학과 이원태 교수님의 단백질-화합물 결합구조 분석을 바탕으로 (사)분자설계연구센터와 한국화학연구원이 화합물의 개량에 나섰으며 그 결과 생체 내 안정성이 높고 뼈 형성 촉진 능력도 향상된 화합물을 찾을 수 있었다. 마침내 개량된 화합물을 쥐 골다공증 모델에 적용한 결과 골밀도가 향상되는 것을 확인함으로써 연구를 마무리할 수 있었다.

사실 CXXC5 결핍 쥐가 뼈 쪽 표현형을 보이기 전에는 뼈 관련 연구에 대해 지식과 경험이 많지 않았다. 뼈 쪽 표현형을 확인하고 나서 의대와 치대를 오가면서 뼈에 대해서 공부하고 실험 기법들을 하나 둘씩 도입하기 시작하였다. 또한 실질적인 화합물의 개발에 나서면서 한국화학연구원, 분자설계연구소를 비롯한 화학 및 약학 기관들의 전문가들과 함께 일하기 시작했고 그를 통해 많은 새로운 것을 배웠다. 공동연구를 통한 단백질의 구조연구도 다양한 경험을 할 수 있는 좋은 기회였다고 생각한다.

재생성 골다공증 치료제 개발을 위한 새로운 타겟으로 Dvl-CXXC5 결합을 제시한 이전 연구의 연장으로 이 결합을 저해할 수 있는 저분자 물질들을 발굴, 개발함으로써 경구투여가 가능하고 생산단가가 낮은 골다공증 치료제의 개발 가능성을 열어주었다.

본 연구를 바탕으로 한 화합물이 임상실험단계를 통과하여 실질적인 치료제로 개발되어 골다공증 치료를 위해 임상에서 널리 쓰일 수 있기를 바란다.

당초 이 논문은 이전에 Cell Death and Differentiation에 발표된 논문과 엮어 단백질 표적의 발굴로부터 시작하여 신약후보물질의 도출까지 이르는 하나의 논문으로 발표될 예정이었다. 하지만 논문의 심사과정은 순탄치 않았으며 거듭되는 게재거절에 적잖이 실망하기도 하였다. 마침내 논문을 둘로 분리하기로 하였으며 그 간 심사위원들이 주었던 지적들을 바탕으로 각각의 논문이 전문성을 살릴 수 있도록 수정하였다. 다행이 분리되어 각각 투고된 두 개의 논문은 심사위원들로부터 대체적으로 좋은 평가를 받고 비교적 수월하게 발표될 수 있었다.

○ 유럽분자생물학기구(European Molecular Biology Organization)에서 발행하는 분자의학 분야의 권위 있는 국제학술지  

○ 세포내에서 다양한 생리 혹은 병리현상을 조절하는 중요한 신호전달계의 하나로 암, 골다공증, 비만, 상처 치유, 모발 형성 등과의 연관성에 대한 연구결과가 최근 발표 되면서 다양한 치료제 개발을 위한 타겟으로 주목받는 신호전달계이다.  

○ CXXC5는 최근 새롭게 규명된 단백질로써 윈트신호전달계를 조절하는 것으로 알려져 있다.

○ CXXC5는 C-말단(terminal)에 Dishevelled 단백질과 결합하는 도메인(DBM, Dishevelled binding motif)을 가지고 있는데 이 부위가 CXXC5 단백질이 윈트신호전달계를 저해하는 기능을 하는데 중요한 역할을 한다.

○ 뼈는 파골세포가 낡은 뼈를 훕수하고 조골세포가 새로운 뼈를 만드는 일련의 과정인 뼈 재형성 과정을 통해 항상성을 유지한다. 

○ 파골세포와 조골세포 간의 균형이 깨지게 되면 골밀도가 비정상적으로 높거나 낮게 되는 질환이 일어난다. 골다공증은 파골세포가 상대적으로 활성화되어 골밀도가 과도하게 낮아지고 이로 인해 쉽게 골절이 일어나게 되는 대표적인 노인성 질환이다. 

○ 윈트신호전달계에서 세포 밖의 신호를 세포 안으로 매개하는 데에 중요한  단백질이다. 윈트 수용체 복합체에 의해 활성화되는 세포질 내 첫 번째 단백질로  윈트신호전달계의 활성화에 첫 관문으로써 역할을 수행한다.

                 

      

그림 1. Dvl-CXXC5 결합 저해제의 검색 및 발굴 : (A) 발현, 정제된 Dvl PDZ domain을 실험접시 바닥에 고정시키고 여기에 결합할 수 있는 펩타이드에 형광물질을 붙여 Dvl-CXXC5 결합 저해제를 검색할 수 있는 고속/고효율 검색 시스템을 개발함. (B) 검색 시스템을 이용, 한국화학연구원이 제공한 화합물 라이브러리로부터 Dvl-CXXC5 결합 저해제를 발굴함. (C-D) 발굴된 저해제들을 조골모세포에 처리하였을 때 윈트 신호전달계의 주요작용단백질인 베타카테닌(β-catenin)의 양 및 핵 내로의 이동이 증가함을 확인함. (E-F) 발굴된 저해제들을 쥐로부터 적출하여 생체 외 배양한 뼈 조직에 처리하였을 때 뼈의 두께성장이 촉진됨을 확인함.

그림 2. KY-02061과 Dvl PDZ 간의 결합구조 연구 : (A) KY-02061의 화학구조. (B) KY-02061이 Dvl-CXXC5 결합을 농도 의존적으로 저해함. (C-E) Dvl PDZ domain과 KY-02061을 다양한 비율로 섞은 후 NMR을 통해 Dvl PDZ domain 상의 아미노산기들의 공간 분포를 확인한 결과 KY-02061에 농도 의존적으로 반응하는 아미노산기들이 있음을 확인함. (F) KY-02061가 Dvl PDZ domain에 PolyR-DBM과 비슷한 방식으로 결합함을 확인함.

그림 3. KY-02061이 조골모세포에 미치는 영향 : (A) 조골모세포에 윈트 신호전달계의 리포터 플라스미드를 도입한 후 KY-02061을 처리한 결과 윈트 신호전달계의 활성이 KY-02061 농도에 의존적인 방식으로 증가함을 확인함. (B) 조골모세포에 KY-02061을 처리한 후 뼈 분화 표지인자인 알칼라인포스파테이즈(alkaline phosphotase)의 활성을 확인한 결과 KY-02061에 농도 의존적인 방식으로 그 활성이 증가함을 확인함. (C) 조골모세포에 KY-02061을 처리한 후 윈트신호전달계의 주요작용인자인 베타카테닌과 뼈 분화 표지인자인 렁스2(Runx2)의 발현을 확인한 결과 KY-02061에 농도 의존적인 방식으로 증가함을 확인함. (D-E) KY-02061를 쥐로부터 적출하여 생체 외 배양한 뼈 조직에 처리하였을 때 뼈의 두께성장이 KY-02061에 농도 의존적인 방식으로 촉진됨을 확인함.

그림 4. KY-02061의 유도체인 KY-02327과 Dvl PDZ 간의 결합구조 연구 : (A) KY-02327의 화학구조. (B) KY-02327이 Dvl-CXXC5 결합을 농도 의존적으로 저해함. (C-F) Dvl PDZ domain과 KY-02327을 다양한 비율로 섞은 후 NMR을 통해 Dvl PDZ domain 상의 아미노산기들의 공간 분포를 확인한 결과 KY-02327에 농도 의존적으로 반응하는 아미노산기들이 있음을 확인함. (G) KY-02327가 Dvl PDZ domain에 KY-02061과 비슷한 방식으로 결합함을 확인함.

그림 5. KY-02327이 조골모세포에 미치는 영향 : (A) 조골모세포에 윈트 신호전달계의 리포터 플라스미드를 도입한 후 KY-02327을 처리한 결과 윈트 신호전달계의 활성이 KY-02327 농도에 의존적인 방식으로 증가함을 확인함. (B, C) 조골모세포에  KY-02327을 처리한 결과 베타카테닌의 양 및 핵 내로의 이동이 KY-02327 농도에 의존적인 방식으로 증가함을 확인함. (D, E) 조골모세포에 KY-02327을 처리한 후 뼈 분화 표지인자인 콜라겐1a(Col1a; D)와 오스테오칼신(OCN; E)의 mRNA 양의 변화를 확인해본 결과 KY-02327에 농도 의존적인 방식으로 증가하였음을 확인함.

그림 6. KY-02327 경구투여가 난소 절제 쥐에 미치는 영향 : 난소 절제 후 4주가 지난 쥐에 4주 동안 KY-02327를 경구투여, 혹은 재조합 부갑상선 호르몬(PTH; 대조군)를 피하주사한 후 조작학적 분석 및 micro-CT를 통한 분석을 수행함. (A-C) KY-02327의 경구투여가 PTH의 피하주사와 비슷한 정도로 새로운 뼈의 형성을 촉진하고 조골세포의 양을 증가시킴을 확인함. (D-H) KY-02327의 경구투여가 PTH의 피하주사와 비슷한 정도로 골밀도, 골량을 증가시키고 경골 해면뼈조직의 양과 치밀도를 증가시킴을 확인함.

그림 7. CXXC5는 Wnt 신호전달계에 대한 음성되먹임작용을 통해 조골세포의 분화를 막음으로써 새로운 뼈 형성의 속도롤 늦춘다(왼쪽). 본 연구진이 금번 연구를 통해 발굴한 새로운 화합물들(KY-02061, KY-02327)은 이러한 음성되먹임작용을 해제함으로써 조골세포 내 Wnt 신호전달계를 활성화하고 이를 통해 조골세포의 분화 촉진 및 새로운 뼈 형성의 속도를 증가시킨다(오른쪽). 새로운 뼈 형성의 속도 증가는 골밀도를 높이는 결과로 이어져 골다공증 등 골밀도의 저하로 인해 나타나는 질환들을 치료하는 효과를 보이게 된다(오른쪽).