행정간행물 등록번호		가이드라인 관리번호
##-#######-####-##		B1-2014-#-###

동종줄기세포치료제 면역독성 평가 가이드라인 (안)

(Considerations in Immunotoxicity Assessment of

Allogenic Stem Cell Therapy Product) (DRAFT)

2014. 9. (예정)

본 가이드라인은 현재까지의 경험과 과학적 사실에 근거하여 동종 줄기세포치료제의 면역독성평가에 대한 식품의약품안전처의 최근 입장을 기술하고 있습니다. 이 가이드라에 기술된 사항 중 법령적, 규정적으로 정하고 있는 사항 외에는 식품의약품안전처의 권고사항이며, 이는 새로운 과학적 근거가 있을 경우 개정될 수 있으므로 이러한 사항이 있을 경우 식품의약품안전처에 의견을 제시하여 주시기 바랍니다.

※ 본 가이드라인에 대하여 의견이 있는 경우 아래로 문의하시기 바랍니다.

식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 세포유전자치료제과	Tel : 043-719-3538 Fax : 043-719-3530	Email : chmr2006@korea.kr

목    차

1. 서 론	1

1.1. 도입	1

1.2. 배경	3

2. 개요	4

3. 시험방법	5

3.1. 비임상시험단계	5

3.1.1. 개요	5

3.1.2. 생체내 시험	6

3.1.3. 시험관내 시험	6

3.2. 임상시험단계	7

3.2.1. 개요	7

3.2.2. 시험방법	7

3.2.3. 결과 및 시험해석	9

4. 맺음말	9

5. 용어정의	10

6. 참고문헌	11

제‧개정이력	12

동종줄기세포치료제 면역독성 평가 가이드라인 (안)

1. 서론

1.1. 도입

본 가이드라인의 발간 목적은 동종줄기세포치료제의 비임상시험 또는 임상시험에서 면역독성 평가를 위한 시험방법 사례를 제시하는데 있다.

적용대상은 「생물학적제제 등의 품목허가‧심사 규정」(식품의약품안전처 고시) 제2조 14호에 따른 “세포치료제”로서,  동종세포치료제에 적용되며 이종세포치료제의 면역독성 평가는 포함하지 아니한다.

동종줄기세포치료제 면역독성 평가 자료는 품목허가 신청이나 임상시험계획승인 신청 시 제출되는 자료이다.

품목허가 시 제출자료는「약사법」제31조, 제35조, 제42조 및「의약품 등의 안전에 관한 규칙」제4조, 제8조부터 제12조에 따라 세포치료제의 제조판매(수입)품목허가 및 변경허가를 위한 심사에 관한 세부사항은 「생물학적제제 등의 품목허가‧심사 규정」(식품의약품안전처 고시)에서 정하고 있다. 동 고시 6조에서는 품목(변경)허가 시 제출되는 심사자료의 종류를 정하고 있는데, 세포치료제에 대해서는 “[별표 2] 세포치료제의 제출자료”에서 그 세부사항을 정하고 있다.

비임상시험에서 면역독성 평가는 위 “[별표 2] 세포치료제의 제출자료”에서 “주 5. 독성에 관한 자료”의 “바. 기타 독성시험 중 면역독성시험”에 따라 동종세포 등에 의해 면역반응을 일으킬 가능성이 있는 경우 면역독성시험이 필요할 수 있으며 단회 또는 반복투여독성시험 등의 부분으로 수행할 수 있도록 하고 있다.

또한 임상시험계획승인 시 제출되는 자료는「약사법」제34조제7항 및 「의약품 등의 안전에 관한 규칙」제24조에 따라 세포치료제의 임상시험계획승인에 필요한 자료의 작성요령, 범위, 요건 등에 대한 세부사항은 「의약품 임상시험 계획 승인에 관한 규정」(식품의약품안전처 고시)에서 정하고 있다. 동 고시 제4조에서는 임상시험계획 (변경)승인 신청시 안전성·유효성과 관련하여 제출하는 자료의 범위를 정하고 있는데,  [별표 1]에 따라 세포치료제는 특성에 따라 제출자료의 범위를 판단하게 된다.

위의 세포치료제의 특성에 따른 제출자료의 범위는 「생물학적제제 등의 품목허가‧심사 규정」(식품의약품안전처 고시)의 “[별표 2] 세포치료제의 제출자료”를 참고할 수 있다.

1.2. 배경

자가세포치료제에서 건강한 사람의 세포를 이용하는 동종줄기세포치료제의 개발이 꾸준히 증가하고 있다. 세포의 기원는 제대혈, 지방, 골수유래 중간엽줄기세포, 신경줄기세포 등이 있으며 이러한 동종줄기세포치료제는 자가유래 세포와는 달리 조직적합성으로 인한 면역거부, 면역원성 유발 등에 대한 논의가 필요하게 되었다.

합성의약품의 경우 ICH 가이던스 등 국제적으로 표준화된 면역독성 평가가이드라인이 제시되고 있는 반면 세포치료제는 현재까지 면역독성을 평가할 만한 적절한 동물모델이나 평가방법에 대한 과학계 합의는 없는게 현실이다. 그럼에도 불구하고 동종줄기세포의 면역독성에 대한 이슈는 배제할 수 없으며 현재 과학계에서 수행되고 있는 시험방법 사례를 모아서 동종줄기세포치료제를 개발하는 경우 면역독성을 고려하여 비임상시험 단계 또는 임상시험 단계에서 수행할 수 있는 방법을 제시하고자 하였다.

동종줄기세포치료제의 면역독성 평가를 주 내용으로 하는 가이드라인은 국내 또는 해외 주요국, 국제기구 등에서 발간된 이력이 없는 것으로 알려져 있다. 다만, 세포치료제 시험정보집으로 중간엽줄기세포치료제 혼합림프구반응시험(2012)에서 혼합림프구반응시험방법을 참고할 수 있다.

2. 개요

세포치료제는 기원에 따라 자가, 동종, 이종유래 세포치료제로 분류할 수 있다. 환자 본인의 조직으로부터 제조된 자가세포치료제에 비해 타인의 조직에서 유래된 동종세포치료제는 공여자와 수여자간 조직적합항원(human leukocyte antigen) 일치여부 등에 의한 면역거부반응을 포함한 면역반응이 유발될 수 있다. 중간엽줄기세포는 과량투여에 의한 과도한 면역억제, 생체내 염증부위에서 조직적합항원의 발현양상 변화, 반복투여에 의한 감작(sensitization) 우려 등이 나타날 개연성이 있다. 이러한 면역반응이 의도하지 않은 면역억제 또는 면역증강을 나타내는 경우 면역독성을 일으킨다고 말할 수 있다.

면역독성은 세포의 기원 이외에도 세포 조작정도, 대상환자군, 투여경로 및 부위 등에 따라 사람에게 면역반응을 일으킬 가능성은 달라질 수 있다. 동종줄기세포치료제의 면역독성에 영향을 미치는 요인은 다음과 같으며, 제품별로 이를 종합적으로 고려하여 비임상시험단계 또는 임상시험단계에서 시험방법을 설정할 수 있다. 또한, 줄기세포 이외에 동종유래 피부각질세포, 섬유아세포 등에 의한 면역독성 평가에도 참고할 수 있다.

가. 세포의 기원 및 표현형(예, 자가, 동종, 이종)

나. 세포의 조작 정도(예, 사이토카인, 성장인자 배양)

다. 세포수

라. 대상환자군

마. 투여경로 및 방법(예, 정맥, 근육, 피하투여)

바. 투여부위(예, 면역관용부위)

사. 투여주기 및 횟수(예, 단회, 반복투여 또는 매주, 매달 투여)

아. 생체내 분포 양상

자. 약리기전(예, 주변분비효과(paracrine effect) 또는 생체내 분화)

차. 생체내 미세환경(예, 생체내 염증환경에 의한 조직적합항원(HLA) 발현양상 변화)

카. 병용약물(예, 면역억제제)

3. 시험방법

3.1. 비임상시험단계

3.1.1. 개요

일반적으로 합성의약품은 반복투여독성시험 등에서 백혈구, 림프구 및 혈청글로불린의 혈액학적 변화, 면역계통 장기의 중량 및 조직학적 변화 등의 표준독성시험결과, 약물 약리학적 특성, 대상환자군, 알려진 면역조절제와 구조 유사성, 약물분포, 임상정보를 기반으로 근거 중심으로 면역독성시험 추가 수행여부를 판단하게 된다. 추가되는 시험의 종류로는 T-세포 의존성 항체반응, 자연살해세포 기능시험, 면역표현형 검사, 숙주저항능 시험, 대식세포/호중구 기능, 세포매개성 면역측정시험법이 있다.

동종줄기세포치료제의 경우에도 단회 또는 반복투여독성시험에서 일반적인 면역계 이상을 평가하고 있으나 면역결핍동물의 면역세포 부재에 따른 면역원성 평가의 한계성 또는 사람유래 세포는 정상동물에서 이종으로 반응하게 되므로 면역독성을 적절히 평가하기 위한 동물모델의 선택은 어려운 문제로 제기되고 있다. 더불어, 사람과 동물간의 면역계 차이로 동물시험을 통해 사람의 면역반응을 대변하는 것도 한계가 있는게 사실이다. 이러한 한계에도 불구하고 현재 과학계에서 수행하고 있는 동종줄기세포치료제 투여에 따른 면역독성 평가방법 예시를 제시하고자 하며 제품의 면역학적 특성 등을 고려하여 선택적으로 수행할 수 있다.

세포의 표현형 중 조직적합항원(HLA)의 발현양상은 면역원성 유발 가능성을 평가하기에 중요한 자료가 될 수 있다. FACS(fluorescence activated cell sorter), RT-PCR(real-time PCR) 등의 시험방법으로 발현양상을 분석할 수 있으며 세포의 특성 규명을 위한 자료에도 필요할 수 있다. 이 외에도 동종줄기세포의 면역원성 평가방안으로 시험동물을 이용한 생체내 시험 및 시험관내 시험으로 혼합림프구시험 사례가 있다.

3.1.2. 생체내 시험(in vivo testing)

임상시험용의약품과 시험동물 사이의 이종거부반응을 피하기 위해서 면역저하(immuno-compromised), 면역결핍(immuno-deficient) 또는 시험동물에 면역억제제를 투여하는 등 적절한 동물종에 임상시험용의약품을 임상예정 투여경로, 투여횟수(주기)에 따라 투여한 후 단회 또는 반복투여독성시험의 시험항목에 따라 면역계이상 여부에 대한 평가를 실시한다. 다만, 면역결핍동물, 정상동물에서 사람유래 세포에 의한 면역원성 평가는 그 평가결과 해석에 한계가 있으므로 면역독성을 면밀히 평가하기 위해서 사람세포와 유사한 동물세포(analogous animal cells)를 사용하여 평가하는 것을 고려할 수 있다. 이 경우 사람세포와 동물세포간의 특성비교, 성장속도, 제조방법의 유사성 등 동등성 평가가 필요하다.

3.1.3. 시험관내 시험(in vitro testing) - 혼합림프구 반응시험

혼합림프구 반응시험은 조직적합항원(HLA)이 서로 다른 두사람의 백혈구를 공동, 배양했을 때 조직적합항원에 의한 비자기 인식정도에 따라 T 세포가 활성화되므로 그 증식정도로 두 사람간의 면역학적 유사성을 판단하고자 수행하는 시험이다. 동일한 원리를 이용하여 동종줄기세포의 면역원성을 평가하고자 사람의 말초혈액 단핵구에 동종줄기세포를 공동, 배양하여 말초혈액의 면역세포 증식여부를 측정하는 방법이다. 이 시험방법은 신뢰성 있는 결과도출을 위해 적절한 양성대조군, 객관적 판정기준 부재 등의 한계가 있으나 일반적으로 가장 흔하게 접근할 수 있는 시험방법으로 알려져 있다.

시험방법

사람의 말초 혈액에서 말초혈액 단핵구(peripheral blood mononuclear cell)를 분리하여 동종줄기세포와 혼합, 배양한다. 세포는 동종줄기세포에 의한 세포증식을 배제하고자 mitomycin C를 일정시간 처리한 세포를 사용한다. PHA(phytohemaggultinin) 등 적절한 양성대조군을 이용하고 BrdU(5-bromo-2'-deoxyuridine), 3H-thymidine, carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFSE) 등 표지인자를 이용하여 동종줄기세포에 의한 말초혈액 단핵구의 증식 정도를 측정한다. 가능하다면 동일한 제조방법으로 자가줄기세포와 동종줄기세포를 제조하여 각각에 의한 면역세포 증식정도를 비교하는 것도 고려할 수 있다. 혼합림프구반응 시험에 대한 보다 상세한 내용은「중간엽줄기세포치료제 혼합림프구반응시험(식품의약품안전평가원, 2012)」을 참고할 수 있다.

3.2 임상시험단계

3.2.1. 개요

임상시험단계에서 동종줄기세포에 의한 면역반응을 면밀히 검색하고 측정하기 위한 시험항목을 설정하는 것이 필요하다. 또한, 면역원성 평가를 위해 줄기세포의 생체내 동태, 투여주기 등을 고려한 검체채취 시기 및 주기를 설정하는 것이 필요하다. 혈액 검체채취는 면역반응의 지속여부를 평가하기 위해서 투여 일정이 완료된 이후를 포함하여 충분한 기간동안 이루어져야 한다. 일반적으로 체액성 또는 세포성 면역반응은 수주 이내에 나타나는 것으로 알려져 있으므로 투여 전, 투여 후 몇 주이내 등 타당한 간격으로 면역반응을 측정하는 것을 권장한다.

3.2.2. 시험방법

1)  체액성 면역반응

체액성 면역반응을 평가하는 방법은 일반적으로 수혈, 임신, 장기이식 등의 과정을 통해 형성되는 조직적합항원에 의한 항체를 검출하는 방법으로 panel reactive antibody(PRA) 검사로 알려져 있다. 대상자가 동종줄기세포를 투여받은 후 조직적합항원에 의한 동종항체 생성여부를 검사하는 시험으로 림프구를 이용하는 세포기반 방법과 추출된 항원을 마이크로프레이트(microplate)나 비드(bead) 등 고체상에 부착하여 혈청 내 항체를 검출하는 방법이 있다. 세포기반 방법으로는 다양한 조직적합항원(HLA)을 발현하는 림프구와 환자 혈청에 존재하는 항체를 결합시킨 후 보체에 의한 세포독성을 관찰하는 보체의존성 세포독성반응(complement-dependent cytotoxicity)이 있다. 고체상을 이용하는 방법으로는 microplate에 부착된 조직적합항원(HLA)을 효소면역측정법(enzyme linked immunosorbant assay)으로 확인하는 방법, flow-beads를 이용하여 유세포분석기로 검출하는 방법, luminex-beads를 이용하여 luminex 장비로 검출하는 방법 등이 있다. 고체상을 이용하여 동종항체를 측정하는 방법이 세포기반 방법 보다는 민감도가 높은 것으로 알려져 있으며 최근 luminex-beads를 이용한 방법이 많이 이용되고 있다. 선별검사결과 항체반응이 양성으로 나타난 경우에는 특이성을 동정하기 위해 단일항원 동정검사를 추가하여야 한다.

2) 세포성 면역반응

비임상시험단계에서 실시한 혼합림프구 반응시험과 동일한 시험방법으로 동종줄기세포를 투여한 환자의 혈액을 검체로 이용하게 된다. 환자의 말초혈액을 동종줄기세포 투여 전․후 채취하여 시험관내에서 투여에 사용된 동종줄기세포와 혼합, 배양을 통해 말초혈액 내에 포함되어 있는 면역세포의 증식정도를 평가한다. 적절한 양성대조군을 설정하여야 하며 건강한 대상자에서 채취한 혈액을 이용할 수도 있다. 혼합림프구반응 시험에 대한 보다 상세한 내용은「중간엽줄기세포치료제 혼합림프구반응시험(식품의약품안전평가원, 2012)」을 참고할 수 있다.

3) 기타

동종줄기세포 투여 전․후 백혈구 수 변화, 림프구 수 비율 변화(예, CD4, CD8 등), 환자의 면역세포에 동종줄기세포치료제를 반응시켜 분비되는 사이토카인(예, IL-γ, IL-2, TNF-α 등) 변화 등을 측정하여 면역반응을 관찰할 수 있다.

3.2.3. 결과 및 시험해석

채액성 면역반응 또는 세포성 면역반응 시험결과에 대한 양성 및 음성에 대한 판정기준 설정이 필요하다. 이에 대한 접근법은 시험방법 등에 따라 다를 수 있고 이에 따라 결정하여야 한다. 동종줄기세포에 의한 면역반응이 유효성의 상실과 안전성의 변화 양상에 반드시 연관되어 있는 것은 아니나 이상반응 같은 안전성 문제는 유효성 상실이 없는 경우에도 일어날 수 있다. 면역반응이 일시적 또는 지속적 양상을 보이는 환자가 있을 수 있으며 지속적 양상을 보이는 환자의 경우 안전성 및 유효성 측면에서 임상적 고려사항이 생길 가능성이 있다.

4. 맺음말

이 가이드라인을 바탕으로 동종줄기세포치료제의 면역독성에 대한 합리적인 평가 시험법이 개발‧적용되어 동종세포에 의해 유발될 수 있는 면역독성 평가가 체계화 되기를 바란다.

5. 용어정의

자가유래세포치료제(Autologous cell therapy products)

환자 자신의 몸에서 살아있는 세포를  채취하여 체외에서 배양, 증식, 선별 등 물리적, 화학적, 생물학적 방법으로 조작하여 제조하는 의약품

동종유래세포치료제(Allogenic cell therapy products)

타인의 몸에서 살아있는 세포를  채취하여 체외에서 배양, 증식, 선별 등 물리적, 화학적, 생물학적 방법으로 조작하여 제조하는 의약품

중간엽줄기세포(Mesenchymal stromal/stem cells)

골수기질, 제대혈, 지방조직에 존재하며 주로 연골, 지방, 근육세포로 분화할 수 있는 중분화능 비조혈계 세포

면역원성(Immunogenecity)

투여된 물질에 의해 면역 반응을 자극하는 항원성 또는 광의의 개념으로 면역계에 미치는 면역반응

면역독성(Immunotoxicity)

의도하지 않은 면역억제 또는 면역증강

조직적합항원(Human leukocyte antigen)

세포막 표면에 있는 유전적으로 결정된 동종항원으로 이식면역, 즉 동종이식의 성패를 결정하는 항원

미세 환경(Microenvironment (niche))

세포의 성질을 결정함에 있어서 중요한 역할을 하는 영영분이나 성장인자와 같은 분자나 복합인자들이 존재하는 장소

동종항체(Alloantibody)

동종으로 다른 개체의 혈구나 조직과 반응하는 항체

6. 참고문헌

의약품의 면역독성평가 가이드라인(2013)

생물의약품 비임상시험 가이드라인(2008)

재조합의약품 면역원성 평가에 관한 가이드라인(2010)

세포치료제 시험정보집 : 중간엽줄기세포치료제 혼합림프구반응 시험(2012)

용역연구개발과제 보고서 : 세포치료제의 질환별 안전성 유효성 평가 동물모델 조사 연구(2013)

정선경, 오은지, 양철우, 안웅식, 김용구, 박연준, 한경자. HLA 동종항체 선별을 위한 ELISA 및 Luminex Panel Reactive Antibody 검사의 비교평가. 대한진단검사의학회지 제29권 제5호; 473-80(2009)

ICH guidance : Immunotoxicity studies for human pharmaceuticals S8(2005)

US FDA guidance for industry : preclinical assessment of investigational cellular and gene therapy product(draft, 2012)

Najib El Haddad, Mesenchymal Stem Cells: Immunology and Therapeutic Benefits. Stem cells in clinic and research 59-82(2011)

Johanne M. Kaplan, Michale E. Youd, Tracey A. Lodie, Immunomodulatory activity of mesenchymal stem cells. Current Stem Cell Research & Therapy 6: 297-316(2011)

M.P. De Miguel, S. Fuentes-Julian, A. Blazquez-Martinez, C.Y.Pascual, M.A.Aller, J. Arias, F. Arnalich-Montiel, Immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells; advances and application. Current Molecular Medicine 12: 574-591(2012)

Jyoti A. Kode, Shayanti Mukherjee, Mugdha V. Joglekar, Anandwardhan A. Hardikar, Mesenchymal stem cells: immunobiology and role in immunomodulation and tissue regeneration. Cytotherapy 11: 377-391(2009)

Antje Gebler, Olivia Zabel, Barbara Seliger, The immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cell. Cell 18; 128-134(2011)

Gebler A, Zabel O, Seliger B., The immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells. Trends Mol Med 18; 128-134(2012)

제‧개정 이력

동종줄기세포치료제 면역독성 평가 가이드라인
제․개정번호	승인일자	주요 내용
B1-2014-#-###	2014. 9 (예정)	줄기세포치료제 면역독성 평가 가이드라인 제정 (예정)

동종줄기세포치료제 면역독성 평가 가이드라인 (안)

발 행 일	2014월 9월 (예정)
발 행 인	바이오생약심사부장 손여원
발행위원
발 행 처	식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 바이오생약심사부 세포유전자치료제과