매사추세츠 공과대학(Massachusetts Institute of Technology)과 하버드 의대(Harvard Medical School)의 연구진은 인체에 안전한 것으로 알려진 다른 생체 임플란트 재료와 매우 유사한 방식으로 그래핀이 반응한다는 것을 증명했다. 또한 이번 연구진은 탄소 나노구조가 얼마나 생체 적합한지를 자세하게 설명했다. 

그래핀 산화된 형태(단지 탄소 원자 한 개 두께를 가진 시트)는 그래핀 자체보다 생물학적 분야에 더 우수하게 적용될 수 있지만, 지금까지 대부분의 연구는 생체 내보다 생체 외의 생체 적합성을 조사하였다. 생체 외 조사들로 이 재료가 용액 속의 특정 농도까지 생물학적 세포에 독성을 가지지 않았다는 것이 밝혀졌다. 

이번 연구진은 동물 속의 복막 조직 사이와 쥐의 피부 아래에 그래핀 산화물을 주입했다. 이번 연구진은 서로 다른 산소 비율의 탄소를 가진 그래핀 산화물의 독특한 상태를 생산하기 위해서 합성에 사용되는 산화제의 양을 변화시켰다. 예를 들어, 기존의 화학량론(stoichiometry)으로 제조된 그래핀 산화물은 2.8:1의 탄소 대 산소 비율을 가지지만, 더 적은 과망간산칼륨을 사용하는 것은 3.1:1의 탄소 대 산소 비율을 가진다. 

이번 연구진은 재료의 산화 상태 간에 어떤 관계성을 가지는지를 조사하였고 이것이 얼마나 생체 적합성을 가지는지를 조사하기 위해서 산화 수준을 변화시켰다. 이번 연구진은 그래핀 산화의 정도를 감소시키는 것이 세포를 더 빠르게 침윤시키고 깨끗하게 하는 결과를 초래한다는 것을 발견했다. 또한 그들은 주입 후에 그래핀 산화물 입자들이 쥐 속의 임플란트와 같이 재료를 형성하기 위해서 합쳐진다는 것을 관찰했다. 그들은 이렇게 스며든 세포가 한 달의 시간 주기 동안에 어떻게 합쳐지는지를 조사했고, 이물에 대한 신체의 자연스러운 반응인 세포의 염증 반응을 조사했다. 

“그래핀 산화물은 나노탄소 재료 중 하나”라고 매사추세츠 공과대학의 Stefanie Sydlik은 말했다. “이런 재료들은 생의학적 분야에 매우 유용한 뛰어난 기계적 및 전기적 특성들을 가진다. 그러나 우리는 그들의 생체 적합성에 대해서 거의 알지 못하고, 높은 표면적과 작은 크기 때문에 그들의 안정성에 대해서 문제를 제기하고 있다. 우리의 연구는 그래핀 산화물이 단기적으로 안전한 것으로 알려진 생체 임플란트와 동일한 방식으로 반응한다는 것을 증명했다”고 Sydlik은 덧붙였다.

이전 연구들은 그래핀 산화물이 용액 속의 적절한 농도에서 세포 독성을 가지지 않다고 나왔기 때문에, 이번 연구진은 이런 결과를 확인하는 연구를 먼저 수행했다. 이번 연구진은 의료용 장치 속의 적용과 관련된 모델 세포로서 미세 혈관 내피 세포주(bEnd.3)와 1차 생쥐로 유래된 중간엽 줄기 세포를 사용했다. 표준 2-색상 세포 독성(standard two-colour live/dead cytotoxicity assay) 분석을 이용함으로써, 이번 연구진은 그래핀 산화물과 환원된 그래핀 산화물이 농도가 높을 경우에 세포에 독성을 주지만 1 mg/mL보다 더 낮은 농도에서는 세포 독성을 가지지 않는다는 것을 발견했다. 

The Amrita Centre for Nanosciences and Molecular Medicine의 Manitha Nair는 “그래핀 산화물의 산화 정도를 감소하는 것은 면역 세포에 재료가 스며들게 하고, 그들이 체내에서 더 빠르게 사라지게 한다. 이것은 차세대 생의학적 분야에서 그래핀 산화물 사용의 적합성을 향상시킬 수 있는 흥미로운 연구결과”라고 말했다. “우리의 연구는 과학자들이 그래핀 산화물의 독특한 특성을 활용하는 의료용 장치 및 임플란트를 조사할 수 있게 하고, 차세대 바이오센서와 삽입할 수 있는 전자장치, 심지어 조직 공학을 위한 지지체에 유용하게 적용될 수 있을 것”이라고 Sydlik은 말했다. 

이번 연구진은 삽입되는 부위에서 그래핀 산화물이 실제로 어떻게 사라지는지를 이해하기 위해서 노력하고 있다. “우리는 산화 정도를 감소하기 위해서 재료를 화학적으로 변화시키고 코팅할 수 있는 방법을 찾고 있다. 이것은 면역 반응을 감소시키는데 도움을 주고 생의학적 분야에 이것의 생체 적합성과 유용성을 추가적으로 향상시킬 수 있을 것”이라고 연구진은 말했다. 이 연구결과는 저널 ACS Nano에 “In Vivo Compatibility of Graphene Oxide with Differing Oxidation States” 라는 제목으로 게재되었다(DOI: 10.1021/acsnano.5b01290).

Apr 16, 2015

The body responds to graphene oxide in much the same way as it does to other biomaterial implant materials that are known to be safe. This is the new result from researchers at the Massachusetts Institute of Technology and Harvard Medical School who have undertaken a detailed study of how biocompatible the carbon nanostructure is.

The oxidized form of graphene (a sheet of carbon just one atom thick) could be better in biological applications than graphene itself but, until now, most research has looked at the material’s biocompatibility in vitro rather than in vivo. The in vitro studies have revealed that the material is not toxic to biological cells up to a certain concentration in solution. 

Researchers led by Robert Langer injected graphene oxide under the skin of mice and between peritoneal tissue in the animals. They varied the amount of oxidizing reagents used in the synthesis to produce distinct states of graphene oxide with different carbon to oxygen ratios. For example, graphene oxide produced with the traditional stoichiometry gave a carbon to oxygen ratio of 2.8:1 while using less potassium permanganate resulted in a form with a carbon to oxygen ratio of 3.1:1. 

Oxidation degree and biocompatibility

The researchers varied the oxidation levels to see if there was any relationship between the material’s oxidative state and how biocompatible it was. They found that reducing the degree of graphene oxidation resulted in the material infiltrating and clearing cells faster. They also observed that after injection, the graphene oxide particles coalesced to form an implant-like material in the mice. They monitored how cells infiltrated this aggregate over a time period of a month and also studied the cells’ inflammatory response, which is a natural reaction to a foreign body. 

“Graphene oxide is part of the class of nanocarbon materials,” explains team member Stefanie Sydlik of the Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT. “These materials have excellent mechanical and electronic properties that would be supremely useful for biomedical applications. However, we still know very little about their biocompatibility and questions have been raised about their safety because of their high surface area and small dimensions. Our work shows that over the short term, the body responds to graphene oxide in much the same way it does other biomaterial implants that we know to be safe.” 

Confirming in vitro studies

Since previous in vitro studies suggested that graphene oxide is not cytotoxic at moderate concentrations in solution, the MIT/Harvard researchers say that they thus first sought to confirm these findings. They used a microvascular endothelial cell line (bEnd.3) and primary murine-derived mesenchymal stem cells as model cells relevant for applications in medical devices. Using a standard two-colour live/dead cytotoxicity assay, they found that both graphene oxide and reduced graphene oxide were toxic to cells at higher concentrations but were not so at concentrations lower than 1 mg/mL in both cell types. 

Manitha Nair of The Amrita Centre for Nanosciences and Molecular Medicine in Kochi, India, comments: “Langer and colleagues have shown that reducing the degree of graphene oxide oxidation allows the material to infiltrate immune cells and clear them faster from the body. This is a relevant and interesting finding that might improve the suitability of using graphene oxide in future biomedical applications." 

Reducing graphene oxide's inflammatory response

“Our work gives researchers the go-ahead to investigate medical devices and implants that tap into the unique properties of graphene oxide, which could lead to a next-generation of biosensors, implantable electronics or even tissue engineering scaffolds,” Sydlik tells nanotechweb.org. 

She adds that her team is now busy trying to understand how the body actually clears graphene oxide from the site it has been implanted in. “We are also looking at chemically modifying and coating the material to reduce its degree of oxidation. This might help reduce the inflammatory response it produces and so further enhance its biocompatibility and utility for biomedical applications.” 

The present work is detailed in ACS Nano DOI: 10.1021/acsnano.5b01290.