암 세포의 악성 정도와 전이를 조기에 확인할 수 있는 단백질이 발견되었다.
한국연구재단(이사장 정민근)은 미래창조과학부 기초연구사업(개인연구)의 지원을 받은 김 준 교수(고려대 생명과학부) 연구팀이 “암 세포주의 전이와 악성이 심하면 특정 단백질이 세포 밖으로 분비되고, 정상세포에서는 분비되지 않는다는 사실을 발견했다”고 밝혔다.
연구팀이 발견한 특정 단백질은 RPS3*. RPS3단백질은 리보솜**을 구성하는 단백질 중 하나이며, DNA 손상복구효소***로도 작용하는 단백질로 알려져 있다. 지금까지는 단백질을 통해 그에 따른 특정 암을 예견할 수 있었으나, 여러 암 세포주를 토대로 리보솜 단백질이 세포 밖으로 분비된다는 사실은 이번에 처음 보고되었다.
* RPS3 단백질 : 리보솜의 작은 서브유닛의 구성 단백질로서 ribosomal small subunit protein 3의 약자이다.
** 리보솜 (ribosome) : RNA와 단백질로 이루어진 복합체로서 세포질 속에서 단백질을 합성하는 역할을 하는 세포소기관
***DNA 손상복구효소 (damage repair enzyme) : 손상받은 생체 DNA를 원상태로 복구해 주는 효소
연구팀은 인간 섬유육종, 피부 흑색소 세포종, 유방암 세포종을 비롯하여 쥐 배아 세포종, 쥐 호염기 백혈병으로부터 파생된 말초 혈관 세포 암세포주를 배양하여 세포 외부로 분비되는 단백질들을 분석하였다. 그 결과, 공통적으로 작은 리보솜을 구성하는 단백질 중 하나인 RPS3라는 단백질이 분비된다는 사실과 특별히 분비된 이 단백질은 RPS3를 구성하는 전체 아미노산 중 165번째에 위치하고 있는 아스파라긴 아미노산****이 당화 반응*****을 통해 변형이 되어야만 분비된다는 사실을 밝혔다.
**** 아스파라긴 아미노산 : 염기성을 띈 필수아미노산
***** 당화(glycosylation) 반응 : 당을 단백질에 전위하는 반응
또한 당화 반응을 통해 세포 외부로 분비된 RPS3 단백질은 암세포주의 악성 정도에 비례하게 분비율이 증가한다는 사실을 확인했다. 이에 따라 생체 내에서 혈액으로 분비된 RPS3 단백질의 양을 조사함으로서 암 발생 가능성과 진행의 정도를 측정할 수 있는 표지로서의 활용 가능성이 제시되었다.
김 준 교수는 “이번 연구성과는 암 발생 가능성과 악성 정도를 혈액을 통해 간편히 측정하고 예측할 수 있는 단백질을 발견한 것이다. 암세포주 실험 단계를 넘어 암환자의 혈액에서 동일한 결과가 증명된다면 간편하게 암의 조기 진단이 가능해져 치료에 기여할 것으로 기대된다.”라고 연구의 의의를 설명했다.
이 연구성과는 저명 암 전문 국제학술지인 온코타겟(Oncotarget) 6월 22일자에 게재되었다.
논문의 주요 내용
□ 논문명, 저자정보
- 논문명 : Ribosomal protein S3 (rpS3) secreted from various cancer cells is N-linked glycosylated
- 저자 정보 : 김 준 (교신저자, 고려대), 김용중 (제1저자, 고려대학교 박사), 이민선 (공동저자, 고려대학교 석사), 김학동 (공동저자, 고려대학교 연구교수)
□ 논문의 주요 내용
1. 연구의 필요성
암환자의 치료는 암세포의 발견 시기에 따라 생존률과 밀접하게 관련되어 있다. 또한 악성종양으로 발달하게 되고 전이가 이루어지게 되면 완치의 확률은 현저하게 떨어지게 된다.
어느 특정 암세포에서만 특징적으로 발현되는 단백질들은 현재까지도 꾸준한 연구를 통해 밝혀지고 있으나, 암환자의 수술을 통한 방법은 아직까지 많은 암치료의 주를 이루고 있는 상황이다.
2. 연구 내용
연구실 내에서 배양되어진 암세포주들 (인간 섬유육종, 피부 흑색소 세포종, 유방암 세포종을 비롯하여 쥐배아(胚芽) 세포종, 쥐 호염기 백혈병으로부터 파생된 말초 혈관 세포 암세포주)로부터 얻어진 배지를 고농축화하여 항원-항체 반응을 수행하였고, 이 중 발견된 RPS3 단백질*의 변형을 조사하기 위해 LC-MS/MS 분석*을 수행하였다.
＊ RPS3 단백질 : 리보솜의 작은 서브유닛의 구성 단백질로서 ribosomal small subunit protein3의 약자
＊ LC-MS/MS 분석 : 질량분석을 통한 액체 크로마토그래피
LC-MS/MS 분석을 통해 분비되는 RPS3 단백질의 165번째 아스파라긴 아미노산이 당화 반응을 한다는 사실을 발견하였고, DNA 재조합기술을 통해 165번째 아미노산의 당화 반응을 억제시킨 세포에서 본 단백질의 분비가 사라짐을 확인함으로서, 단백질 분비에 있어서 필수적인 반응임을 알 수 있었다.
3. 연구 성과
이 연구에서 RPS3 단백질의 당화 반응을 억제시켰을 때 세포의 악성인 상태가 감소됨을 확인하였으며, 또한 암세포주의 전이 또한 감소함을 발견하였다. 암세포주의 전이 및 악성 정도에 따라 RPS3 단백질의 분비 정도 또한 비례하게 나타나는 것을 토대로 RPS3 단백질은 암세포주의 악성 상태를 표지할 수 있는 표지 단백질이라 할 수 있다.
더 나아가 환자의 혈액으로부터 당화 RPS3 단백질의 분비량을 측정하여 암환자의 암세포 전이 상태와 전이를 진단할 수 있을 것으로 기대한다.
암 환자의 혈액을 통해 RPS3 단백질뿐만 아니라 표지 단백질로 사용 가능한 다양한 단백질을 추출, 확인하여 더욱 정밀하게 암세포의 전이 및 진단을 가능하게 할 수 있을 것으로 기대한다.
향후 이 단백질에 대한 당화를 억제하면 암전이 및 치료가 가능한지의 여부는 세포수준에서 확인한 결과이므로 동물실험을 통해 재확인하여야 하며, 환자의 혈액시료의 임상 연구를 통하여 특정 암의 진단 여부를 추후 연구할 계획이다.
연 구 결 과 개 요
1. 연구배경
오늘날 인류를 가장 위협하는 질병 중 하나인 암을 정복하기 위해 치료법과 예방법등 여러 분야에서 연구가 활발히 진행되고 있다. 암이 진행이 되어 가면서 생체 내 여러 곳으로 전이가 되고 나면 어떠한 치료법도 환자를 살리는데 보장할 수 없음이 오늘 현실이다. 이러한 시대에 암의 전이 정도와 악성 정도를 손쉽고 빠르게 진단 및 측정할 수 있는 방법은 암 정복에 크게 한 발 내딛는 도약이 될 것이다.
2. 연구내용
연구팀은 다양한 암세포주를 배양하여 얻어진 배지에서 분비를 위한 단백질 변형인 당화 반응을 주목하였다. 이에 작은 리보솜 구성 단백질인 RPS3가 공통적으로 당화 반응 후 분비됨을 확인하였고, 전이 및 악성 암세포일수록 분비율이 증가함을 확인하였다. 이는 당화 반응을 억제시켰을 때 암세포주의 전이 및 악성 정도가 줄어듦으로서 암세포주의 전이 및 악성을 나타내는 표지 단백질로서의 활용 가능성을 확인하였다.
단백질이 세포 외부로 분비가 되기 위한 방법 중 하나인 당화 과정은 분비단백질을 전문적으로 연구함으로서 잘 알려진 사실이다. 본 연구팀은 수년 전에 당화 단백질만을 잡는 특정물질을 이용하여 RPS3 단백질이 당화됨을 확인한 바 있다. 또한 본 연구진에서는 이 단백질이 각종 암세포주 및 암환자 세포에서 과발현이 됨을 발견하였다. 당시 본 단백질의 기능을 더 이상 확인할 수 없었으나, 최근에는 여러 가지 실험 기법이 발달함에 따라 RPS3 단백질이 당화 과정을 거쳐 소포체(ER) 및 골지체(Golgi)를 통하여 세포 외부로 분비되는 단백질임을 형광현미경과 LC-MS/MS 크로마토그래피 분석법을 통하여 확인이 가능하였다. 또한 유전자조작법을 통하여 당화과정을 위한 아미노산 위치를 확인할 수 있었고, 그에 따른 기능은 세포의 전이 및 악성 종양의 특성인 세포의 이주 속도를 측정할 수 있는 상처 치료 복구 방법(wound-healing assay*) 과 세포의 특이 형태를 관찰할 수 있는 3D 배양법**을 확인함으로서 증명할 수 있었다.
*상처 치료 복구법 (wound-healing assay) : 세포 배양 시 세포 배양 용기에 흔적을 남겨 세포들에 의해서 흔적이 복구되는 시간을 측정함으로서 세포의 이동 속도를 비교하는 실험기법
**3D 배양법 : 겔(gel) 상태에서 세포를 배양한 후 이를 현미경을 통해 관찰하여 세포의 특이적인 모양을 관찰하는 실험 기법
3. 기대효과
연구실 내의 다양한 암세포주에서 분비되는 특정 단백질의 당화 반응은 환자 혈액에서의 동일한 현상을 확인할 필요가 있다. 이 후 혈액 내로 분비되는 당화된 RPS3 단백질과 암환자의 암 전이 및 악성 정도가 확립이 된다면 암 환자의 암세포 전이 단계 및 악성 정도를 극소량의 혈액 샘플만으로 단시간에 측정 및 진단할 수 있을 것이다.
뿐만 아니라 다양한 암세포주에서 암세포의 전이 및 악성 정도를 특징지을 수 있는 다양한 단백질들을 발굴해 낸다면 더욱 정확한 암세포의 전이와 악성 정도의 진단 및 측정이 가능해질 것이다.
★ 연구 이야기 ★
□ 연구를 시작한 계기나 배경은?
본 연구팀은 사실 작은 리보솜 구성 단백질 중 하나인 RPS3 의 기능을 전문적으로 연구하는 팀이다. 수년전 S3 단백질이 DNA 손상복구효로로 작용함을 밝혔으며, 또한 암전이 억제 단백질 중 하나인 nm23-H1 과 상호작용을 하여 암전이에 영향을 미친다는 사실을 발견하였었고, 이후 암 전이와 본 단백질의 관계를 규명하기 위해 노력해 왔다.
□ 연구 전개 과정에 대한 소개
이전에 본 연구팀에서 보고한 바 있는 암전이 억제 단백질과 상호 작용을 하여 암세포의 전이를 억제시킨다는 사실을 확인한 바 있어, 이 단백질이 암전이와 관계가 있음을 알게 되었고, 따라서 본 연구팀에서는 이 메커니즘을 밝히고자 노력하였고 RPS3 단백질의 세포내 기능과 세포 밖으로 분비되었을 때 본 단백질은 당화 반응을 거치게 된다는 사실에 새로운 사실을 발견하게 되었다.
□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소가 있었다면 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?
분비되는 단백질의 규명은 여러 가지 극복해야 하는 문제점들이 존재한다. 단순히 세포가 터지면서 (자살-apoptosis 이나 괴사-necrosis를 통해) 세포 밖으로 흘러나온 것이 아닌, 세포 내 어떤 메커니즘을 통한 의미있는 경로를 통해야만 분비라 명할 수 있기 때문이다. 이를 증명하기 위하여 우리는 당화 반응을 확인할 수 있었고, 이는 명백한 세포내 소포체-골지체 경로를 통한 의미 있는 분비 과정이라 확인하였다. 가장 큰 문제점이자 해결해 나가야 할 점은 연구실내의 결과를 임상에 적용하는 과정일 것이다. 본 연구팀의 이번 발견을 암 전이 및 악성 조기 진단의 가능성으로 정의한다면, 환자 혈액 내에서 동일한 현상을 증명함은 암 조기진단의 새로운 가능성으로 정의할 수 있을 것이다.
□ 이번 성과, 무엇이 다른가?
지금까지 와의 다른 점은 특정 암에서의 특정 단백질로 대표할 수 있는 표지 단백질 발굴에서 본 연구팀의 다양한 암세포 주를 통합하여 동일한 단백질의 변형과 전이 및 악성 정도에 비례한 분비를 확인하여 응용할 수 있다는 것이며, 또한 본 연구를 토대로 또 다른 암 전이 및 악성 정도를 대표할 수 있는 다양한 표지 단백질을 발굴할 수 있는 기초를 확보했다는 데 있을 것이다.
□ 꼭 이루고 싶은 목표와 향후 연구계획은?
본 연구팀은 이번에 확인된 RPS3의 당화 반응을 감지할 수 있는 항체를 개발 중에 있으며, 암환자의 혈액 내에서 동일한 현상을 확인하기 위한 협력을 기다리고 있는 중이다. 이 항체가 개발 완료가 되어 환자 혈액 내에서 RPS3 단백질의 당화 반응의 현상이 동일하게 증명이 되어 암전이 및 악성 정도와 RPS3 단백질의 분비율이 정립되면, 암으로 의심되는 환자의 극소량의 혈액만으로 암을 진단할 수 있을 것이며, 전이 정도의 지표를 만들 수 있을 것으로 기대한다.
□ 기타 특별한 에피소드가 있었다면?
한 때 이전 발견과 상반되는 결과로 연구실내에서 고민을 많이 한 적이 있었다. 이는 둘 중 하나는 분명 잘못된 결과가 아닌가하는 편협된 생각이었지만, 생명을 갖는 모든 생명체에서는 어떠한 상황도 100%라는 것은 없다는 결론을 받아 들일 수밖에 없는 결과이다. 가장 작은 단위인 세포에서조차도 우리는 우리의 지식이 얼마나 제한적이며 한정된 것인지를 알게 되고 한없이 겸손하게 되는 결과였다.
용 어 설 명
1. 온코타겟(Oncotarget)
. 암전문 국제 학술지
2. RPS3 단백질
. 리보솜의 작은 서브유닛의 구성 단백질로서 ribosomal small subunit protein 3의 약자이다.
3. 리보솜 (ribosome)
. RNA와 단백질로 이루어진 복합체로서 세포질 속에서 단백질을 합성하는 역할을 하는 세포소기관
4. 아스파라긴 아미노산
. 염기성을 띈 생체 필수아미노산
5. 당화(glycosylation)반응
. 당을 단백질에 전위하는 반응
6. DNA 손상복구효소(damage repair enzyme)
. 손상 받은 생체 DNA를 원상태로 복구해 주는 효소
7. LC-MS/MS분석
. 질량분석을 통한 액체 크로마토그래피
8. 소포체 (ER; endoplasmic reticulum)
. 세포 밖으로 분비되는 단백질의 합성 및 변형을 담당하는 세포소기관
9. 골지체 (Golgi apparatus)
. 세포 밖으로 분비되는 단백질의 변형 및 수송을 담당하는 세포소기관
10. 상처 치료 복구법(wound-healing assay)
. 세포 배양 시 세포 배양 플레이트에 흔적을 남겨 세포들에 의해서 흔적이 복구되는 시간을 측정함으로서 세포의 이동 속도를 비교하는 실험기법
11. 3D 배양법
. 겔(gel) 상태에서 세포를 배양한 후 이를 현미경을 통해 관찰하여 세포의 특이적인 모양을 관찰하는 실험 기법
그 림 설 명
(그림 1). 세포 내 소포체-골지체(ER-Golgi) 분비경로를 저지시키는 화합물인 브레펠딘(Brefeldin) A(BFA) 처리 후 작은 리보솜 단백질 S3 (RPS3) 와 소포체 (ER)
해당 단백질을 만났을 시 녹색을 띄는 RPS3 단백질 항체와 소포체(ER)에 특이적으로 붙어 붉은 색을 띄는 항체를 사용하여 각각 지시하는 부분을 형광현미경으로 확인하였다. 그림1 은 세포의 분비과정 중 하나인 ER 에서 Golgi 로의 경로를 억제시켰을 때 (BFA+) 억제되지 않은 상태 (BFA-)에 비하여 RPS3 단백질(녹색)의 분비 과정 중 ER(붉은색)에서 저지되어 겹쳐진 사진에서 노란색을 보임으로서 RPS3 단백질이 ER을 통한 분비 과정이 이루어짐을 알 수 있다.
(그림 2) 암세포주의 전이율 측정 실험
세포 내에 정상 RPS3 단백질을 과발현 시켰을 때 (FLAG-rpS3) 와 당화 반응을 억제시킨 RPS3 단백질을 과발현시켰을 때 (FLAG_N165G) 암세포주의 전이율을 비교하였다. 16시간 후 (16hr) 당화 반응을 억제시킨 RPS3 단백질은 대조군에 비하여 전이율이 현저히 떨어져 있음을 확인하였다. 이는 암세포의 전이력을 설명할 수 있는 실험이다.
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(그림 3) 암세포의 악성화를 확인할 수 있는 세포형태 측정 실험
세포 내에 정상 RPS3 단백질을 과발현 시켰을 때 (FLAG-rpS3) 와 당화 반응을 억제시킨 RPS3 단백질을 과발현 시켰을 때 (FLAG_N165G) 암세포주의 악성화 형태를 비교하였다. 당화 반응을 억제시킨 S3 단백질은 대조군에 비하여 암세포의 악성화 형태를 설명할 수 있는 돌출부가 사라짐을 확인하였다. 이는 암세포의 악성 정도를 설명할 수 있는 실험이다.
