식중독균을 제어할 수 신규 항미생물제제 개발 가능성 제시
미래창조과학부(장관 최양희)는 DNA*에 결합하여 생명체의 유전자 발현을 조절하는 단백질인 억제인자*와 항-억제인자*의 새로운 구조를 밝혀 기존의 방식과 다른 결합 및 분리 작용이 일어난다는 것을 규명하였다.
* DNA : 자연에 존재하는 2종류의 핵산 중에서 디옥시리보오스를 가지고 있는 핵산으로 유전자의 본체를 이룸
* 억제인자 : 생명체의 DNA에 결합하여 유전자의 발현을 저해하는 조절 단백질
* 항-억제인자 : 억제인자 단백질에 결합하여 억제인자가 제 기능을 하지 못하게 만드는 단백질
유상렬 교수 ․ 이형호 교수(서울대) 연구팀은 미래창조과학부 기초연구사업(개인연구 등) 등의 지원으로 연구를 수행했으며, 다학제 분야의 세계적인 학술지 PNAS 온라인판 4월 20일자에 게재되었다.
논문명과 저자 정보는 다음과 같다.
- 논문명 : Noncanonical DNA-binding mode of repressor and its disassembly by antirepressor
- 저자 정보 : 유상렬 교수(공동교신저자, 서울대), 이형호 교수(교신저자, 서울대), 김민식 박사(공동제1저자, 서울대), 김희정 박사과정생(공동제1저자, 국민대), 손상현 연구원(공동저자, 국민대), 윤혜진 교수(공동저자, 서울대), 임영빈 박사(공동저자, 서울대), 이종우 연구원(공동저자, 서울대), 석영재 교수(공동저자, 서울대), 진경식 박사(공동저자, 포항가속기연구소), 유연규 교수(공동저자, 국민대), 김성근 교수(공동저자, 서울대)
논문의 주요 내용은 다음과 같다.
1. 연구의 필요성
DNA에 결합하는 억제인자*는 다양한 생명체에서 유전자의 전사 개시*를 저해함으로써 해당 유전자의 발현을 조절하는 단백질이다. 원하는 특정 유전자를 발현시키기 위해서는 DNA로부터 이 억제인자를 떨어뜨리는 것이 필수적이다. 따라서 DNA에 안정되게 결합하고 있는 억제인자를 떼어내는 메커니즘이 다각도로 연구되었다.
* 전사 개시 : 유전자를 암호화하고 있는 DNA가 RNA로 해독되는 과정의 시작
지금까지는 억제인자 자체를 분해하거나 항-억제인자*를 이용해 DNA로부터 억제인자를 떼어내는 방식 등이 밝혀져 있다. 이 가운데 항-억제인자가 관여하는 통상적인 방식은 DNA 구조를 모방하는 항-억제인자가 DNA 대신 억제인자에 경쟁적으로 결합함으로써 억제인자의 DNA 결합을 방해하는 방식이다.
2. 연구 내용
살모넬라균*과 같은 식중독 원인균은 다양한 병원성 유전자를 발현함으로써 식중독을 일으킨다. 연구팀은 살모넬라균을 특이적으로 감염시키는 박테리오파지*인 SPC32H로 부터 기존에 보고된 것과는 종류가 다른 억제인자(Rep), 항-억제인자(Ant) 쌍을 발견하고 이의 작동 방식을 규명하고자 연구를 시작하였다.
* 살모넬라균: 국·내외 주요 식중독 원인균 중 하나로 급성 위장염 등을 일으킴
* 박테리오파지: 세균만을 특이적으로 감염시키는 바이러스로 세균 바이러스라고도 부름
먼저 X-선 결정학 기법*을 이용해 두 단백질 복합체의 고해상도 3차원 구조를 규명하였다. 지금까지 대부분의 억제인자는 2량체를 이루어 DNA에 결합하는 것으로 알려져 있다. 연구팀은 이번 연구의 억제인자가 4량체를 이루어 DNA에 결합하며, 특히 서로 다른 2개의 비대칭적 2량체로부터 각각 하나씩의 DNA 결합 도메인*이 관여하여 DNA에 결합한다는 새로운 사실을 밝혔다.
* X-선 결정학 기법 : 생체고분자의 3차원 구조를 규명하기 위한 생물물리학적 기법으로 생체고분자 단결정의 X-선 회절 패턴을 분석하여 전자밀도 지도를 획득, 원자 수준의 고해상도 3차원 구조를 규명함.
* 4량체 : 단백질 분자 4개가 모여 기능을 나타내는 단위체
* DNA 결합 도메인: 3차원 구조를 바탕으로 한 단백질의 부위 중 DNA에 결합하는 데에 관여하는 부위
또한 항-억제인자 4량체는 이러한 억제인자 4량체 가운데에서 억제인자와 결합하여 이형 8량 복합체*를 형성하며, 이로 인하여 억제인자가 더 이상 DNA에 결합하지 못하게 만든다는 사실을 확인했다.
* 이형 8량 복합체 : 서로 다른 2종 이상의 단백질 분자가 8개 모여 기능을 나타내는 단위체
3. 연구 성과
억제인자의 새로운 작동 방식과 더불어 항-억제인자의 결합에 의한 DNA로부터의 분리 메커니즘을 밝힘으로써 기존의 방식 뿐만 아니라 다양한 방식으로 억제인자가 작용하여 유전자의 발현을 정밀하게 조절할 수 있음을 처음으로 밝혔다.
이 연구 결과는 미생물 세포의 유전자 발현을 조절하는 새로운 방법을 개발하는 데에 활용할 수 있을 것으로 기대된다. 특히 억제인자-항-억제인자 쌍을 다양한 식중독균에 적용할 수 있다면 식중독균이 병을 일으키는데 필요한 유전자 발현을 선별적으로 조절할 수 있을 것이다. 이를 통해 항생제의 저항성을 유발하지 않으면서 효과적으로 식중독균을 제어할 수 있는 새로운 방법의 항미생물제제 개발의 가능성을 제시할 수 있을 것이다.
유상렬 교수는 “이번 연구 성과는 유전자의 발현을 저해하는 조절 단백질이 DNA에 어떻게 결합하는지, 어떻게 분리되는지에 대한 새로운 발견이다. 이 조절 단백질이 식중독균의 병원성 유전자 발현을 조절할 수 있도록 추가 연구가 진행된다면 식중독 원인균에 대한 새로운 항미생물제제를 개발하는데 기여할 수 있을 것이다”라고 연구의 의의를 설명했다.
연 구 결 과 개 요
1. 연구배경
억제인자는 DNA에 결합하여 유전자의 발현을 저해하는 조절 단백질이다. 다양한 방법으로 이 억제인자와 DNA 간의 상호작용을 와해하여야 원하는 유전자의 발현이 시작될 수 있다. 가장 대표적인 방식은 작은 유도체 분자*가 억제인자에 결합하여 DNA로부터 억제인자를 떼어내는 방식이다. 이러한 유도체 분자의 결합은 억제인자의 3차원적 구조를 변화시키거나 억제인자의 분해를 유발함으로써 DNA로부터 억제인자를 분리시킨다.
* 유도체 분자 : 유전자 발현을 유도하기 위하여 항억제인자와 동일한 방식으로 작용하는 물질
억제인자를 DNA로부터 떼어내기 위한 또 다른 방식은 항-억제인자가 억제인자의 DNA 결합 부위에 대해 경쟁적으로 결합하는 것이다. 이를 위하여 항-억제인자는 DNA의 구조를 모방하는 것이 일반적이며, 다양한 생명체에서 각기 다른 구조의 이러한 항-억제인자가 발견되고 있다. 이들은 공통적으로 단백질 표면의 전하* 분포가 DNA의 그것과 유사하다는 특징이 있다. 지금까지는 이러한 특징을 바탕으로 억제인자에 결합하는 항-억제인자의 메커니즘만이 밝혀져 있었다.
* 전하 : 전기현상을 일으키는 주원인으로 어떤 물질이 갖고 있는 전기의 양
연구팀은 높은 친화력을 가지는 억제인자와 DNA간의 상호작용을 와해시키는 항-억제인자의 또 다른 작동 방식을 밝혀보고자 하였다. 연구의 대상으로는 이전 연구를 통해 기존에 연구되었던 억제인자-항-억제인자와는 구조적으로 다를 것이라고 예상되는 살모넬라균 특이적 박테리오파지 SPC32H의 억제인자-항-억제인자 쌍을 선정하여 연구를 진행하였다.
2. 연구내용
연구팀은 박테리오파지 SPC32H의 억제인자(Rep) 및 항-억제인자(Ant) 단백질을 대장균에서 대량 발현시켜 정제하고, X-선 결정학 기법*을 이용하여 이 두 단백질의 이형 복합체에 대하여 고해상도 3차원 구조를 규명하였다. 또한 억제인자(Rep) 일부(아미노산 92-198)의 복합체 구조에 대해서도 고해상도 3차원 구조를 규명하였다.
＊ X-선 결정학 기법 : 생체고분자의 3차원 구조를 규명하기 위한 생물물리학적 기법으로 생체고분자 단결정의 X-선 회절 패턴을 분석하여 전자밀도 지도를 획득, 원자 수준의 고해상도 3차원 구조를 규명함.
구조를 분석하고 이를 바탕으로 생화학적 실험을 수행한 결과, 억제인자(Rep)는 그 농도에 따라 2량체 2개가 비대칭적으로 결합하여 동형 4량체를 형성함을 알 수 있었다. 또한 억제인자-항-억제인자(Rep-Ant) 복합체는 억제인자(Rep) 4량체에 항-억제인자(Ant) 4량체가 결합한 이형 8량체의 복합체를 이룬다는 사실을 확인할 수 있었다. 통상적으로 억제인자는 2량체로 존재하는 것으로 알려져 있으므로 4량체를 형성하는 억제인자(Rep)는 새로운 형태라 말할 수 있었다.
억제인자-항-억제인자(Rep-Ant) 복합체가 기존에 연구된 억제인자-항-억제인자의 복합체와 다른 점은 항-억제인자(Ant)가 억제인자(Rep)의 DNA 결합 부위에 경쟁적으로 결합하는 것이 아니라 DNA 결합과는 상관없는 다른 두 부위에서 결합하고 있다는 점이었다. 흥미롭게도 이 두 부위 중 한 부위는 억제인자(Rep)가 4량체를 형성하는 데에도 관여하고 있었으므로 항-억제인자(Ant)가 억제인자(Rep)의 4량체 형성을 방해함으로써 DNA로부터 억제인자(Rep)를 분리시키는 것이라고 예측할 수 있었다. 실제로 해당 부위가 망가진 억제인자(Rep)는 높은 농도에서도 4량체를 형성하지 못하고 2량체로만 존재했으며, 생분자 반응 분석 실험을 통해 DNA에 결합하지 못함을 확인하였다.
이러한 결과들을 종합하여 이번 연구의 억제인자(Rep)는 기존의 통상적인 억제인자들과는 다른 방식으로 DNA에 결합함을 제시할 수 있었다. 즉 기존의 억제인자들의 경우 하나의 2량체가 독립적으로 DNA에 결합하는 cis형 모델이다. 반면, 이번 연구의 억제인자(Rep)는 4량체를 구성하는 서로 다른 2개의 2량체에서 각각 하나씩의 DNA 결합 부위가 이합체화하여 DNA에 결합하게 되는 trans형 모델이었다. 이는 하나의 억제인자(Rep) 4량체가 2분자의 DNA에 결합할 수 있음을 말해주며, 생화학적 실험들을 통하여 실제로 그러함을 확인할 수 있었다. 나아가 돌연변이를 도입한 박테리오파지를 실제로 구축하여 억제인자(Rep)에 항-억제인자(Ant)가 결합하지 못할 경우 정상적인 유전자 발현이 불가능하여 기대하는 표현형이 나타나지 못한다는 사실을 확인하였다.
＊ cis : 같은 면을 뜻하는 라틴어로 이 연구에서는 억제인자 4량체를 구성하는 2개의 2량체가 각각 자신과 같은 면에 위치하는 DNA에 결합함을 의미한다.
＊ trans : 다른 면을 뜻하는 라틴어로 위의 cis형과 달리 억제인자 4량체를 구성하는 2개의 2량체가 자신과 다른 면에 위치하는 DNA에 결합함을 의미한다.
3. 기대효과
이번 연구에서는 DNA에 결합하는 억제인자와 그 결합을 와해시키는 항-억제인자가 형성하는 복합체의 3차원 구조를 고해상도로 밝혔다. 이를 바탕으로 다양한 생화학적·분자생물학적 실험을 수행하여 억제인자 및 항-억제인자가 작동하는 새로운 메커니즘을 제시할 수 있었다.
이와 같은 억제인자 및 항-억제인자의 새로운 작동 방식 및 그 원리는 연구 대상 단백질의 출처인 박테리오파지뿐만 아니라 보다 고등한 생물들에게서도 적용되고 있을 것으로 예상된다. 때문에 다양한 작동 원리를 가지는 억제인자 및 항-억제인자에 대한 연구가 앞으로 수행될 수 있을 것으로 기대된다는 점에서 학문적 의의가 크다.
살모넬라균과 같은 식중독 원인균은 다양한 병원성 유전자를 발현함으로써 식중독을 일으킨다. 따라서 이번 연구의 억제인자(Rep)와 항-억제인자(Ant) 쌍에 의하여 특정한 병원성 유전자의 발현이 선별적으로 조절되도록 재조합한 박테리오파지를 만든다면 이를 활용하여 향후 다양한 식중독균을 제어할 수 있는 새로운 패러다임의 항미생물제제 개발이 가능할 것으로 기대된다.
★ 연구 이야기 ★
□ 연구를 시작한 계기나 배경은?
주요 식중독균인 살모넬라균의 제어를 위해 이를 특이적으로 감염시키는 박테리오파지 SPC32H에 대해 연구하는 도중 이 파지가 기존과는 다른 억제인자 및 항-억제인자를 가지고 있음을 알게 되었고, 그 작동 원리를 밝히기 위해 억제인자와 항-억제인자 복합체의 3차원 구조 연구를 시작하게 되었다.
□ 연구 전개 과정에 대한 소개
연구 대상인 두 단백질을 고농도·순도로 정제하여 그 복합체의 3차원 구조를 X-선 결정학 기법을 이용하여 규명하였다. 억제인자 및 항-억제인자의 작동 원리를 밝히기 위하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC-MALS), 표면 플라즈몬 공명 실험(SPR), 생분자 반응 분석 실험(BLI) 등의 생화학적 연구를 수행하였으며, 전기영동 이동도 변화 실험(EMSA), 이중 플라스미드 리포터 실험(dual plasmid reporter assay) 등의 분자생물학적 연구도 수행하였다. 나아가 박테리오파지 SPC32H의 항-억제인자에 돌연변이를 도입한 재조합 파지를 구축해봄으로써 실제로 특정 유전자(파지의 생활사 전환을 위한 유전자)의 발현을 통한 표현형 변화를 위하여 항-억제인자가 억제인자에 특이적으로 결합할 필요가 있음을 생체 내 실험으로 검증하였다.
□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소가 있었다면 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?
논문 심사 과정에서 심사자 중 한 명이 제시한 다른 모델의 가능성을 기각하고 대신 우리 연구팀이 제안한 모델을 설득하고자 하였다. 이를 위하여 이미 수행하였던 생화학적 실험을 비특이적 신호가 없이 더 정교하고 정밀하게 재수행할 필요가 있었다. 이에 크로마토그래피 컬럼 등 주요 연구 기자재를 새롭게 구매하여 실험을 재수행 하였고, 표준편차가 훨씬 줄어든 좀 더 나은 결과를 얻게 되어 심사자를 무사히 설득할 수 있었다.
□ 이번 성과, 무엇이 다른가?
기존에 억제인자가 작동하는 방식은 하나의 2량체가 독립적으로 DNA에 결합하는 cis형 모델인 반면, 이번 연구의 억제인자(Rep)는 4량체를 구성하는 서로 다른 2개의 2량체에서 각각 하나씩의 DNA 결합 부위가 이합체화하여 DNA에 결합하게 되는 trans형 모델이라는 점이 특징적이다. 이 때문에 DNA 결합을 위해서는 억제인자가 4량체를 형성하는 것이 필수적인데, 항-억제인자가 이러한 4량체 형성을 저해함으로써 억제인자가 DNA로부터 분리되게끔 한다는 사실을 새롭게 밝혔다.
□ 꼭 이루고 싶은 목표와, 향후 연구계획은?
이번 연구의 대상인 억제인자-항-억제인자(Rep-Ant)는 본래 살모넬라균을 감염시키는 박테리오파지 SPC32H에서 유래한 단백질이다. 따라서 살모넬라균 등 식중독균을 제어하기 위한 재조합 박테리오파지를 구축하는 데에 이를 활용하여 새로운 패러다임의 항미생물제제를 개발해 보고 싶다.
□ 기타 특별한 에피소드가 있었다면?
2009년에 닭의 분변시료에서 새롭게 분리한 파지 SPC32H와 SPC32N이 용균반(plaque)의 형태가 서로 미묘하게 다른 점에 주목하여 처음 연구를 시작하였다. 눈에 띄지 않는 차이라며 가볍게 여기는 시선도 있었지만 원인을 찾기 위해 꾸준히 연구를 계속하였다. 그 결과, 2013년에 기존에는 알려진 적이 없던 항-억제인자(Ant)에 의해 그 차이가 비롯된다는 것을 논문으로 발표할 수 있었으며, 더 나아가 이번과 같은 우수한 연구 성과로 이어질 수 있었다. 면밀한 관찰을 바탕으로 아무리 사소한 것이라도 간과하지 않고 그 원인을 밝히기 위해 노력하는 것이 ‘과학’이라는 학문을 행하는 자세라는 점을 다시 한 번 배울 수 있었다.
용 어 설 명
1. 미국국립과학원회보(PNAS U.S.A.)
미국국립과학원회보(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America)는 미국국립과학원(NAS)에서 발간하는 학술지로 다학제 분야(Multidisciplinary science)에서 상위 10% (4/57; IF 9.674, 2014년 기준)에 속하는 세계적으로 권위 있는 학술지이다.
2. 억제인자(repressor)
생명체의 DNA에 결합하여 유전자의 발현을 저해하는 단백질이다. 해당 유전자의 발현을 개시하기 위해서는 이 억제인자를 DNA로부터 유리하는 것이 필수적이다. 유전자 발현을 시기적절하게 조절하기 위해서 생명체는 다양한 억제인자를 가지고 있다.
3. 항-억제인자(antirepressor)
억제인자 단백질에 결합하여 억제인자가 제 기능을 하지 못하게 만드는 단백질이다. 항-억제인자의 작용결과 억제인자가 DNA로부터 유리되어 특정 유전자의 발현을 가능하게 한다. 통상적으로는 DNA와 유사한 표면 전하 분포를 가지는 단백질로 억제인자의 DNA 결합 부위에 경쟁적으로 결합하여 억제인자가 DNA에 결합하지 못하도록 하는 작동방식을 가지고 있다.
4. 살모넬라균(Salmonella spp.)
장내 세균과에 속하는 그람 음성의 통상혐기성균으로 주요 식중독 원인균 중 하나이다. 주로 살모넬라균에 오염된 식품·식수를 섭취함으로써 감염이 일어난다. 건강한 성인에게서는 수일 내에 자연 회복되는 복통, 설사를 수반하는 급성 위장염의 증상을 일으키지만 소아, 노인, 면역이 약화된 환자에게서는 균혈증을 일으켜 생명을 위협하기도 한다. 일부 살모넬라 균주는 제1군 감염병인 장티푸스를 일으키기도 한다. 미국의 경우 2000년~2008년 분석된 식중독 원인균들 중 가장 높은 감염 및 사망건수를 보이며, 국내에서도 식중독 사고를 기록하기 시작한 2002년 이래로 매년 사고가 발생하여 2015년 현재에는 살모넬라에 의한 13건의 식중독 사고와 202명의 감염자가 보고되고 있다.
5. 박테리오파지(bacteriophage)
세균만을 특이적으로 감염하는 바이러스로 세균 바이러스라고도 부른다. 흙이나 하천 등 주변의 다양한 환경뿐만 아니라 우리가 섭취하는 음용수나 식품, 그리고 장 내에도 널리 존재하는 것으로 알려져 있다. 숙주가 되는 특정 세균 종만을 인지하여 자신의 유전체를 숙주 세균에 주입하며, 숙주의 시스템을 이용하여 자신의 유전체를 복제하고 개체를 증식시킨 뒤 최종 단계로 숙주 세균을 터뜨리고 환경 중으로 방출되어 나온다. 현대 분자생물학의 발전에 큰 기여를 했으며 특히 유전물질이 단백질이 아니라 DNA임을 밝히는 데에 박테리오파지가 이용되었다.
6. 4량체(tetramer)
단백질 분자 4개가 모여 기능을 나타내는 단위체를 말한다. 억제인자(Rep)의 경우 2개의 억제인자(Rep) 분자가 모인 2량체 2개가 화합하여 4량체를 형성함으로써 DNA에 결합하는 활성을 나타낸다. 항억제인자(Ant)의 경우 항억제인자(Ant) 분자 4개가 모인 4량체가 기본 단위체이다.
7. DNA 결합 도메인(DNA-binding domain)
3차원 구조를 바탕으로 한 단백질의 부위 중 DNA에 결합하는 데에 관여하는 부위를 DNA 결합 도메인이라고 칭한다.
그 림 설 명
그림 1. 억제인자-항-억제인자(Rep-Ant) 이형8량체의 리본 도식(A) 및 표면 도식(B)
각 단백질 사슬을 서로 다른 색깔로 나타내었으며(억제인자: 분홍색, 노란색, 초록색, 하늘색; 항-억제인자: 파란색, 갈색, 주황색, 회색), 표시한 축을 기준으로 90°회전시킨 이형 8량체의 각 도식을 오른쪽에 나타냈다. 회색으로 표시한 DNA-결합 도메인은 보이지 않는 2개의 DNA-결합 도메인(노란색 및 하늘색)을 의미한다.
그림 2. 억제인자-항-억제인자(Rep-Ant)의 작용 방식 모델
억제인자의 2량체 두 개가 모여 4량체를 이루면서 2분자의 DNA에 결합함으로써 특정 유전자의 발현을 저해한다(1). 이때 DNA 결합에 관여하는 두 DNA-결합 도메인은 서로 다른 2량체에서 유래하는 특징이 있다. 이후 특정한 숙주 반응 신호에 의해서 항-억제인자(Ant)가 발현되면(2) 항-억제인자(Ant)의 4량체는 억제인자(Rep) 4량체의 가운데 부분에 끼어 들어가 두 부위에서 억제인자(Rep)와 결합하면서 억제인자-항-억제인자(Rep-Ant)의 이형8량체를 형성한다(3). 이로써 억제인자(Rep)는 DNA로부터 유리되며(4), 이에 따라 저해되고 있던 유전자의 발현 개시가 가능해진다.
